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1.
A 559 base pair fragment of cDNA locating at the putative E2 region of GBV-C/HGV was in-serted into Pichia pastoris expression vector pPICgK in the reading frame of α-factor secreting signal pep-tide. The recombinant expression plasmid pPIC9K-E2 was introduced into P. pastoris GSll5 with electro-poration and recombined with the host genome by homological recombination. The His+Mut+ recombinantyeasts were selected and cultivated in the BMMY medium. After 3 days induction with 0. 5% methanol,the target protein(E2) accumulated up to 30% of total proteins in the supernatant. The expressed E2 pro-tein was proved possessing antigenicity and high specificity with Western blot and ELISA probed with serafrom the immunized rabbits and the patients infected by GBV-C/HGV. 相似文献
2.
重组人巨细胞病毒(HCMV)嵌合肽在毕赤酵母中的表达 总被引:2,自引:1,他引:2
目的:在巴期德毕赤酵母中表达人巨细胞病毒gp52C末端和pp150C末端串联片段的嵌合肽,方法:用SacI和BglⅡ分别酶切CMVp-pPIC9K重组质粒,电打孔法导入毕赤酵母GS115后,在缺组氨酸的MD板上筛选出转化子,然后根据甲醇利用快速型(Mut^ )和甲醇利用缓慢型(Mut^s)菌株的不同生长特点,筛选出Mut^ 和Mut^s型转化子,用PCR法进一步鉴定阳性克隆,分别用甲醇诱导Mut^ 和Mut^s型转化子表达目的蛋白4d,取培养产物冻干浓缩,进行SDS-PAGE和Western blotting,筛选出能特异表达目的的蛋白的菌株,分析蛋白的含量及纯度。结果:重组人巨细胞病毒可在甲醇利用快速型毕赤酵母中有效表达,其表达量约占培养上清分泌蛋白的76.5%,结论:重组人巨细胞病毒(HCMV)嵌合肽可在真核细胞毕赤酵母中成功表达。 相似文献
3.
通过酶学性质比较毕赤酵母GS115表达的E.coli K12植酸酶(appA)及其突变体植酸酶(appA NR)和黑曲霉植酸酶(phyA)的最适pH、温度、热稳定性及对胃蛋白酶和胰蛋白酶的耐受性.结果表明,在95℃,加热10 min,appA NR可残余90%左右的活力,而其他两种只残余20%~50%的活力;appAN... 相似文献
4.
重组毕赤酵母G12-CBS经代谢工程改造,可高效表达重组S-腺苷甲硫氨酸(SAM)合成酶,并弱化了SAM转化途径的关键酶β-胱硫醚合成酶,是一株优良的SAM高产菌。为了利用G12-CBS高效合成SAM,需对前体(甲硫氨酸)的补料策略进行优化。首先在摇瓶中考察了不同甲硫氨酸(L-Methionine,L-Met)添加量对于G12-CBS的影响,发现每24hL-Met补加量超过3mg/mL时,会影响重组菌生长和SAM合成。在15L发酵罐中优化L-Met的补料速率,当外源补料速率为0.4g/(L·h)时SAM产量最高,分别比补料速率为0.2g/(L·h)和0.6g/(L·h)时提高22.2%和31.8%,达到13.01g/L,比出发菌最高产量提高54%。代谢物及酶活测定的结果表明,较低的L-Met补料速率(0.2g/(L·h))导致前体供应不足而影响SAM合成,过高的补料速率(0.6g/(L·h))可能会抑制三羧酸循环,并且影响氮源的摄取和利用,从而导致菌体生长和产物合成受到抑制。 相似文献
5.
利用转基因毕赤酵母高表达小分子药用多肽的研究 总被引:5,自引:2,他引:5
天然小肽Gsp有明显的降血糖功效,由59个氨基酸残基组成.其编码基因由本实验室设计、合成,并重组构建成表达质粒pPIC9-Gsp. 经电穿孔将该质粒转化为毕赤酵母GS115(His4- mut+),挑选His+ muts型菌株进行重组蛋白胞外表达研究.表达蛋白经Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳分析确定了相对分子质量的正确性,其氨基酸测序显示与天然多肽序列一致,并经紫外扫描分析确定了表达量为344mg/L左右. 相似文献
6.
根据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子使用偏爱性,对Escherichia coli来源的高比活植酸酶基因(appA)全面地进行密码子优化,人工合成了植酸酶基因(appA-P),并将该基因克隆到毕赤酵母诱导型分泌表达载体pHBM905A上,获得重组质粒pHBM905A-appA-P,通过PEG1000转化法将线性化的重组质粒转化毕赤酵母GS115菌株,筛选得到一个高效表达植酸酶的重组菌株GS115-appA-P,在25℃摇瓶培养168 h后酶活力达到422 U/mL,该植酸酶最适反应温度为60℃,最适反应pH为4.5,在20~50℃、pH1.0~6.0范围内较稳定. 相似文献
7.
本试验将能够成功表达重组人血清白蛋白(rHSA)的巴斯德毕赤酵母培养至诱导期后,流加亚硒酸钠,同时设空白对照发酵液(不加入亚硒酸钠),通过对比相同菌株在两组培养基中表达的rHSA的含硒量,判断硒能否以硒代氨基酸的形式存在于重组蛋白质中。发酵液经热处理、超滤、离子交换和丙酮沉淀等步骤后,进行Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳、X射线能量色散谱(EDX)和原子吸收分析。结果表明,加硒发酵液样品中硒元素的质量分数比对照多23.2%,硒与蛋白质的质量比为0.0069,高于对照发酵液近35倍,初步证明无机硒可以被毕赤酵母同化,转化为硒代氨基酸,并形成硒代重组蛋白质。 相似文献
8.
甜蛋白Monellin在巴斯德毕赤氏酵母中的胞内表达 总被引:1,自引:0,他引:1
将PCR扩增得到的Monellin基因片段插入Pichia pastoris胞内表达质粒Ppic3.5k‘,然后转入Pichia pastoris SMD 1168受体菌中,用G418筛选高拷贝菌株,并进一步对其进行PCR鉴定,获得的阳性克隆菌株经甲醇诱导60h,SDS-PAGE结果显示菌株破壁液中含有表达的Monellin,其大小约为11ku,并具有甜度。 相似文献
9.
抗菌肽AD基因的改造及在毕赤酵母中的表达 总被引:14,自引:0,他引:14
采用PCR技术改造抗菌肽AD基因,将其C末端改造为Asn编码,改造后的抗菌肽Cecropin AD基因克隆到pPICZα-A载体上,构建成酵母重组分泌型表达载体,转化毕赤酵母(Pichia pastoris)受体菌GS115中,采用zerocin抗性标记筛选重组转化子,经摇瓶发酵,浓缩发酵液进行酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析和抑菌活性检测。结果表明,改造后的Cecropin AD基因在毕赤酵母中获得了表达,表达产物经α-Factor信号肽引导分泌到胞外,具有较强的杀菌活性。 相似文献
10.
树干毕赤酵母连续发酵戊糖己糖生成酒精 总被引:4,自引:1,他引:4
以30g/L葡萄糖和15g/L木糖混合物为发酵底物,在工作体积约为1.5L的全混釜生物反应器中,对一株树干毕赤酵母驯化菌株P2进行了一级和二级连续发酵研究。结果表明,在一级连续发酵木糖、葡萄糖混合物中,当稀释率为0.06h-1时,酒精产率达到最大0.790g/(L·h),发酵溢出液中酒精浓度为13.16g/L,还原糖利用率仅为77.51%。在二级连续发酵木糖、葡萄糖混合物时,当底物流加速度约为60mL/h时,发酵液酒精浓度为13.23~14.85g/L,还原糖利用为83.23%~84.37%。 相似文献