煤工尘肺结核患者肺部细菌感染及耐药性研究

研究淮南矿区煤工尘肺结核患者肺部产超广谱β-内酰胺酶细菌感染及其耐药情况.对从煤工尘肺结核肺部感染患者痰标本分离的132株革兰阴性杆菌进行ESBLs检测,并对产ESBLs细菌进行药物敏感性检测.共计检出产ESBLs细菌31株,占全部测试菌株的23.48%,其中主要包括肺炎克雷伯菌15株,大肠埃希菌13株.产ESBLs细菌对氨苄西林均高度耐药;对头孢噻肟、头孢他定等第三代头孢菌素类也高度耐药;而头孢西丁对产ESBLs肺炎克雷伯菌及大肠埃希菌有较强的抗菌效果,但产ESBLs铜绿假单孢菌和阴沟肠杆菌对头孢西丁的耐药率却高达100%;除铜绿假单胞菌外的产ESBLs细菌对亚胺培南的敏感率极高;奈替米星、阿米卡星及氧氟沙星、环丙沙星对产ESBLs细菌抗菌作用较弱.淮南矿区煤工尘肺结核患者肺部产ESBLs细菌感染以产ESBLs肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌引起的肺部感染为主要要致病菌,亚胺培南可作为治疗产ESBLs细菌(铜绿假单胞菌除外)的首选药物,临床应采取措施以预防产ESBLs细菌肺部感染的发生.     

58例肺结核患者肺功能分析

目的：探讨肺结核对肺功能的影响。方法：回顾分析58例肺结核患者的肺功能。结果：浸润型肺结核肺功能大致正常，慢性纤维空洞型肺结核肺功能普遍异常。结论：肺结核的肺功能障碍呈混合性。     

夫西地酸联合抗生素抑制脓肿分枝杆菌的研究

为了探究针对脓肿分枝杆菌的抑菌方案,本研究采用MABA法测定夫西地酸等药物对脓肿分枝杆菌标准菌株及临床分离株的最小抑菌浓度MICs,棋盘稀释法测定联合抑菌作用,以及平板涂布法测定最小杀菌浓度MBCs.结果表明,单用夫西地酸、阿奇霉素、头孢曲松钠、贝达喹啉对脓肿分枝杆菌标准株的MIC90与MBC分别为50、6.25、3.13、3.13 μg/mL与 50、12.5、3.13、6.25 μg/mL, 夫西地酸联用阿奇霉素的协同指数FICI从0.09~2.0不等;夫西地酸对脓肿分枝杆菌具有良好的体外抑菌活性,且夫西地酸与阿奇霉素联用后对标准株与临床株表现出明显的协同效应,相比单药作用极大地降低药物的MIC及MBC;其与头孢曲松钠联用后对标准株与临床株分别表现出协同、相加作用;与贝达喹啉联用后对标准株与临床株分别表现出相加、无关作用.     

结核分枝杆菌esat6-cfp 10融合基因的克隆表达及纯化

获得esat6-cfp 10重组蛋白,为研究其在结核病诊断和预防中的作用奠定一定基础。以结核杆菌H37,Rv基因组DNA为模板,克隆cfp10基因,将其插入到pGEM-7ZF( )克隆载体后与esat6基因连接,构建含有esat6和cfp10融合基因的克隆载体esat6-cfp 10。酶切消化esat6-cfp 10重组质粒,将esat6-cfp 10基因亚克隆到pPROEX^TM HTb原核表达载体,经IPTG诱导后,可表达出分子量约28kD的esat6-cfp 10融合蛋白,重组蛋白经镍柱纯化后,得到了高纯度的esat6-cfp 10融合蛋白。Western blot证明表达重组蛋白有较好的免疫原性。     

西藏拉萨地区198株结核分枝杆菌耐药性分析

目的：了解拉萨地区结核分枝杆菌对抗结核药物的耐药情况,为临床合理用药提供参考依据。方法：采用WHO推荐的比例法对分离自西藏拉萨地区肺结核患者的198株结核分枝杆菌进行4种抗结核药物（RFP、INH、SM、LVX）的药物敏感性试验。结果：198株结核分枝杆菌中耐药菌株有125株,总耐药率为63.1%（125/198）,总耐多药率为29.8%（59/198）,初治耐药率为55.1%（64/116）,复治耐药率为75.4%（40/53）,初治耐多药率为20.7%（24/116）,复治耐多药率为56.7%（30/53）。对RFP、INH、SM、LVX的耐药率分别为36.3%（72/198）、41.9%（83/198）、41.4%（82/198）和7.0%（14/198）。结论：西藏拉萨地区临床结核分枝杆菌耐药情况较为严重,应加强临床结核分枝杆菌耐药性监测,指导临床用药以防控耐药菌的产生。     

r结核分枝杆菌PhoP／PhoR基因重组穿梭表达质粒的构建及鉴定

为构建结核杆菌PhoPR双组分系统PhoP、PhoR基因的重组穿梭质粒pMV361-PhoP、pMV361-PhoR并对其进行鉴定。采用结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株基因组DNA为模版,利用PCR技术分别扩增PhoP、PhoR基因编码序列,先克隆于T—Vector pMD19（Simple）,再亚克隆至大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pMV361,并转化E.coli DH5α感受态细胞,提取所得的阳性克隆子获得重组表达质粒pMV361-PhoP、pMV361-PhoR,通过PCR及双酶切鉴定。结果显示,结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株基因组DNA中扩增出的PhoP、PhoR基因与GenBank公布的序列一致,经过PCR及双酶切鉴定,表明PhoP、PhoR基因均成功插入了pMV361穿梭载体。由此可知,成功构建了重组穿梭质粒pMV361-PhoP、pMV361-PhoR,为进一步研究PhoPR双组分系统奠定了基础。     

抗结核杆菌人源噬菌体单链抗体库的构建及筛选

目的:构建人源噬菌体展示单链抗体(ScFv)库,筛选抗结核杆菌特异性、高亲和力的ScFv.方法:从结核患者的外周血淋巴细胞中,提取RNA并通过RT-PCR扩增出VH和VL基因,并采用SOE-PCR构建ScFv基因,将其克隆入噬粒载pC ANTA B5E中,转化于大肠杆菌TG1,通过辅助噬菌体M13K07援救构建噬菌体单...     

结核分支杆菌Ag85B DNA疫苗构建、免疫原性及其保护效力

构建结核分支杆菌分泌蛋白Ag85B编码基因的DNA疫苗,研究其免疫原性和保护效力.构建该DNA疫苗并经鉴定后,应用Qiagen试剂盒大量纯化无内毒素的质粒DNA.将C57BL/6小鼠随机分为4组,分别3周间隔3次用生理盐水（A）、载体质粒（B）、卡介苗（C）、Ag85B DNA疫苗（D）免疫小鼠,通过ELISA方法检测血清中抗Ag85B抗体及其亚型.第三次免疫后28 d用结核分支杆菌H37Rv攻击,观察小鼠体重变化,攻击4周后检测细胞因子IFN-γ、IL-12,进行肺组织病理检查及菌落计数等.经Ag85B DNA疫苗免疫的小鼠特异性抗体IgG均显著高于对照组,而且IgG2b均高于IgG1和IgG2a.结核分支杆菌攻击后各组小鼠体重变化呈现不同趋势,A、B组小鼠体重从第3周开始下降;C组体重总体呈上升趋势;D组体重第2周开始下降,之后维持不变.MTT法检测脾淋巴细胞增殖实验中D组的刺激指数显著高于其它组;D组小鼠脾淋巴细胞转化率也显著高于A、B组.肺组织菌落计数C组最低,其次是D组.大体病理结果显示C组和D组肺组织病变较A、B组轻.A、B组肺泡腔内有较多渗出液,肺泡壁充血、水肿.C组肉芽肿数目最多.上述结果表明Ag85B DNA疫苗具有较强的免疫原性,呈TH1型细胞介导的免疫应答.Ag85B DNA疫苗的免疫保护效力不如BCG,有待进一步研究其应用价值.     

特异性抗体和特异性免疫复合物的检测对结核病的诊断意义

以ＥＬＩＳＡ检测１０８例活动性肺结核、３９例稳定期肺结核、３０例肿瘤、１０１例非结核性肺部疾病患者及２０２例正常人血清的抗结核菌纯蛋白衍生物（ＰＰＤ）ＩｇＧ抗体（简称抗－ＰＰＤ）和循环免疫复合物（ＣＩＣ）中的抗－ＰＰＤＩｇＧ抗体（简称ＣＩＣ－ＰＰＤ）。结果表明，活动性肺结核患者的抗－ＰＰＤ和ＣＩＣ－ＰＰＤ水平明显高于正常人和各疾病组患者的水平（Ｐ＜０．００１），但与其病变范围无关。单一测定活动性肺结核患者的抗－ＰＰＤ，敏感性为８５．２％，特异性为９８．５％；测定ＣＩＣ－ＰＰＤ，敏感性为８６．１％．特异性９６．９％。以两者任一项阳性作为诊断活动性肺结核的标准，则敏感性为９３．５％。此外，对１１例活动性肺结核患者的动态观察表明，随着治疗天数的增加和临床症状的改善，患者的抗－ＰＰＤ和ＣＩＣ－ＰＰＤ水平会逐渐降低，前者于治疗后第２０～２４周降至正常水平，后者则于治疗后第１２～１６周降至正常值。研究结果提示测定患者的抗－ＰＰＤ和ＣＩＣ－ＰＰＤ的水平，可用于结核病诊断，对结核病的疗效判定亦有帮助。     

Construction of multivalent DNA vaccines forMycobacterium tuberculosis and its immunogenicity

The coding regions of Ag85B MPT-64, and ESAT-6 secreted proteins were cloned initially into the eukaryotic expression vector pJW4303, then transformed to E. coli Top 10 strain for plasmid DNA extraction and further analysis. Plasmids containing the right insertion were sequenced to confirm their identity. COS7 cells were transfected with a mixture containing serially diluted plasmid DNA encoding three secreted proteins and Lipofectin (Gibco). The supernatants and pellets prepared from various cell lines were run on SDS-PAGE gel and the expression of these proteins in COS7 cells were demonstrated by immunoblot using polyclonal or monoclonal antiserum of M.TBH37Rv. 21 days after first vaccination of C57BL-6 mice by all three recombinant eukaryotic expressing vectors, antibody titer for Ag85B reached 1∶3200. 21 days after second vaccination, the antibody titer reached 1∶102400. The highest antibody levels induced by multivalent vaccines after the second injection were equal to or even greater than the highest antibody levels of single DNA vaccine reported in literature after third injections. Antibody titer of MPT-64 was 1∶50 after the first injection and it reached 1∶200 after the second injection. No antigen-specific antibody against ESAT-6 was detected in sera harvested from immunized mice 21 days after both injections. Antigen-specific IFN-g level of Ag85B was 110 pg/mL while no antigen-specific IFN- g level of ESAT-6 and MPT-64 was detected even after third injections. To our knowledge, it is the first time that studies of polyvalent recombinant DNA vaccines against TB were carried out in C57BL-6 mice. Our results indicated that multiple DNA vaccines could be used to enhance protective responses against M.TB.