运用HSV－tk／ACV系统进行肿瘤基因治疗研究

构建了含ｐｇｋ启动子驱动的ＨＳＶ－ｔｋ基因的反转录病毒载体ｐＬＮＴＫ，将ＨＳＶ－ｔｋ基因转移至人脑胶质瘤ＳＨＧ４４细胞（命名为ＳＨＧＬＮＴＫ）及小鼠黑色素瘤细胞Ｂ１６（命名为Ｂ１６ＬＮＴＫ）．体外实验证实核着类似物ＡＣＶ对ＳＨＧＬＮＴＫ细胞和Ｂ１６ＬＮＴＫ细胞的杀伤敏感性分别高于亲本细胞１０００和４００倍．转ＨＳＶ－ｔｋ基因细胞与亲本细胞按不同比例共培养时，亲本细胞对ＡＣＶ的敏感性明显增高，存在旁观者效应．首次应用人脑胶质瘤细胞株进行裸鼠体内实验，结果表明：ＡＣＶ能完全抑制ＳＨＧＬＮＴＫ细胞在裸小鼠体内肿瘤的形成，对裸小鼠体内已形成的ＳＨＧＬＮＴＫ肿瘤的治疗效果与对照ＳＨＧ４４肿瘤相比，肿瘤体积缩小８０％；用Ｂ１６ＬＮＴＫ细胞接种同系Ｃ５７／ＢＬ小鼠，经ＡＣＶ治疗后，Ｂ１６ＬＮＴＫ组小鼠的肿瘤较对照组Ｂ１６肿瘤小９５％．ＨＳＶ－ＴＫ／ＡＣＶ系统原位基因转移治疗ＳＨＧ荷瘤裸小鼠、Ｂ１６荷瘤小鼠，原位注射病毒悬液／ＡＣＶ治疗组的ＳＨＧ肿瘤、Ｂ１６肿瘤分别较对照组肿瘤小５０％，４３％，原位注射ＰＡ３１７／ＬＮＴＫ细胞，ＡＣＶ治疗的ＳＨＧ肿瘤较对照组肿瘤小９０％，以上实验结果，统计学上差异极显著，Ｐ＜０．０１．实验     

乳腺癌特异性多肽介导生物大分子体内外效应

探讨乳腺癌特异性多肽PI携带外源性生物大分子靶向抗肿瘤的作用.将分离纯化获得的融合蛋白PI-EGFP与靶细胞MDA-MB-231体外共培养,探讨融合蛋白与靶细胞的结合能力;将此融合蛋白经尾静脉及肿瘤局部注射入荷瘤裸鼠体内,探讨其在肿瘤部位的聚集程度;利用分子克隆技术构建重组原核表达载体pET-28a(+)-pI-tk,诱导表达、分离纯化、鉴定获得的融合蛋白PI-HSV-TK,将不同浓度的融合蛋白与MDA-MB-231细胞共培养,经更昔洛韦(ganciclovir,GCV)作用后,探讨PI-HSV-tk对细胞的靶向杀伤效应.荧光显微镜下观察,在靶细胞内可检测到绿色荧光信号,经尾静脉及局部注射融合蛋白PI-EGFP后,在不同组织器官可见不同强度的荧光信号,在尾静脉注射组的肾脏和肿瘤部位可检测到荧光信号,而局部注射组仅在肿瘤部位可检测到;成功构建了重组原核表达载体pET-28a(+)-pI-tk;分离纯化获得高效表达的PI-TK融合蛋白,SDS-PAGE电泳及Western blotting鉴定融合蛋白的表达正确;CCK-8法及流式细胞仪检测显示,GCV对转导融合蛋白的MDA-MB-231细胞有杀伤作用,IC50值为152.64μg/mL.乳腺癌特异性转导多肽能携带生物大分子进入靶细胞,并携带具有杀伤效应的物质,使其发挥靶向治疗作用,为进一步探讨该多肽作为靶向性载体奠定实验基础和理论依据.     

单纯疱疾病毒胸苷激酶基因的脑肿瘤基因治疗研究

单纯疱疾病毒胸苷激酶基因（HerpesSimplexVirus－ThymidineKinase,HSV－tk）,配合核苷酸类似物（NAS）GCV或ACV的基因治疗是目前肿瘤基因治疗领域中一种较有希望的治疗方法．反转录病毒和腺病毒介导的HSV－tk／NAS肿瘤基因治疗系统的建立,并运用该系统进行脑胶质瘤、垂体瘤、黑色素瘤的基因治疗离体细胞和动物试验,取得了显著的肿瘤杀伤作用,特别是腺病毒介导的脑胶质瘤基因治疗动物试验效果很显著,能够完全消除肿瘤．同时,还建立了反转录病毒以及腺病毒HSV－tk基因治疗的安全性检测体系,为基因治疗的临床试验提供了安全性保证．     

带HSV－tk基因的重组腺病毒杀伤离体肺癌细胞的研究

带有单纯疱疹病毒脱氧胸苷激酶基因（ＨＳＶ－ｔｋ）的腺病毒结合ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ（ＧＣＶ）对分裂细胞有很强的杀伤作用．在感染复数（Ｍ．Ｏ．Ｉ,ＭｕｌｔｉＰｌｉｃｉｔｙｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｎ）达到１０００时对人体肺腺癌细胞Ａ５４９的杀伤几乎达到１００％．四种人体肺癌细胞株（Ａ５４９,ＬＡＸ,ＳＰＣ,ＳＫＹ）对带ＨＳＶ－ｔｋ的腺病毒（ＡＤＶ／ＲＳＶ－ｔｋ）的杀伤作用表现出不同的敏感性．另Ａｃｙｃｌｏｖｉｒ（ＡＣＶ）和ＧＣＶ对感染了重组腺病毒ＡＤＶ／ＲＳＶ－ｔｋ的细胞都有一定杀伤作用,但杀伤效果有很大差别;就Ａ５４９而言,ＧＣＶ的杀伤作用比ＡＣＶ高７～８倍．此外ＡＤＶ／ＲＳＶ－ｔｋ结合ＧＣＶ杀伤肿瘤细胞时有“旁观者效应”,即感染了ＡＤＶ／ＲＳＶ－ｔｋ的细胞与未感染细胞混合后,后者也明显地遭到杀伤．