甘油脱水酶的研究进展

甘油脱水酶是微生物发酵法生产3-羟基丙醛和1,3-丙二醇过程中的关键限速酶.文中对甘油脱水酶的结构与功能、作用机制、基因工程研究等情况进行综述,探讨了甘油脱水酶的研究进展并提出一些建议.     

Rational design of glycerol dehydratase： Swapping the genes encoding the subunits of glycerol dehydratase to improve enzymatic properties

1,3-propanediol (1,3-PD) is an important material for chemical industry,and there has been always much interest in the production of 1,3-PD using all possible routes. The genes encoding glyc-erol dehydratase (GDHt) from Citrobacter freundii,Klebsiella pneumoniae and metagenome were cloned and expressed in E. coli. All glycerol dehy-dratases but the one from metagenome could be detected to show enzyme activities. In order to im-prove the enzymatic properties of GDHts,the genes encoding α and β-γ subunits were cloned,and the enzyme characteristics were evolved by rational de-sign based on their 3D structures which were con-structed by homology modeling. Six heteroenzymes were obtained by swapping the α subunit genes of these three different-source-derived GDHts. The pH,thermal stability and Vmax of some heteroenzymes were dramatically improved by 2―5 times compared with the wild one (GDHtKP). The GDHt cloned from metagenome,originally proved to be with no enzyme activity,was converted into active enzyme by swap-ping its subunits with other different GDHts. In addi-tion,the effect of subtle 3D structural changes on the properties of the enzyme was also observed.     

一株产NAD+依赖型甘油脱氢酶嗜热杆菌的筛选

将采集于清源山、华大后山果园、华大南浦果园、实验室附近等多处的高温堆肥样品在60℃、pH7.0条件下进行富集培养,其中南浦果园堆肥样品菌体长势较好,菌株呈暗绿色;逐步提高培养基中甘油浓度(0.5g/L~3g/L),进行菌株产甘油脱氢酶(GDH)的驯化培养与复筛,经8个批次的复筛,获得一株产GDH酶活达0.201U/mL的棕色菌株,编号TB8-5;经镜检分析同时结合菌落生长特性并经生理生化实验反应鉴定,初步判断筛选出的菌株属嗜热芽孢杆菌属;菌株发酵液中产物组分鉴定为二羟基丙酮(DHA),含量为0.597mg/mL,相应的GDH酶活也最高,其最适反应温度为50℃,最适反应条件pH为8.0,Zn2 对酶活有一定的促进作用.     

气相色谱法测定工业甘油含量

本文使用Ｃｈｒｏｍｏｓｏｒｂ—１０１固定相作为柱填料，采用气相色谱法测定水溶液中甘油。操作过程简便，测定结果准确。实验选择了最佳汽化温度、柱温和载气流速。     

利用5-氨基乙酰丙酸脱水酶缺失的重组大肠杆菌合成5-氨基乙酰丙酸

生物法合成5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)大多通过添加5-ALA脱水酶(ALAD)的抑制剂乙酰丙酸(LA)减少5-ALA的降解,造成生产成本增高,发酵工艺复杂.本文利用ALAD缺失的大肠杆菌ZSEc2作为出发菌株,通过紫外诱变的方法,获得可利用外源血红素恢复正常生长的大肠杆菌突变株ZGEc1,并过表达来自沼泽红假单胞菌的5-ALA合成酶(ALAS)基因,最终建立一条不需要添加ALAD抑制剂的5-ALA的生物合成新路线.经过培养基初步优化,重组菌可在胞外积累约1,g/L的5-ALA.     

高效液相色谱法测甘油缩甲醛中游离甲醛

介绍了一种利用高效液相色谱法测定甘油缩甲醛中游离甲醛含量的方法。结果表明：进样量在0．02—0．5μg范围内线性关系良好,r为0．9995,平均回收率分别为101．6％,RSD为1．9％。说明该方法准确、可靠,可为甘油缩甲醛产品质量控制提供一定的理论依据。     

盐胁迫下酿酒酵母和鲁氏酵母渗透调节方式的对比与分析

酵母菌是耐盐的真核模式生物.为了研究酵母菌在不同盐胁迫条件下的渗透调节方式,本文以不同条件对酿酒酵母和鲁氏酵母进行盐胁迫处理,利用高碘酸钠—乙酰丙酮法及蒽酮-硫酸法分别对盐胁迫下酿酒酵母和鲁氏酵母产生的甘油和海藻糖含量进行了测定、分析与比较.结果表明,在不同盐胁迫条件下酿酒酵母和鲁氏酵母细胞内均迅速积累大量的甘油和海藻糖.盐胁迫下鲁氏酵母以甘油调节渗透平衡的能力高于酿酒酵母以甘油调节渗透平衡的能力,盐胁迫下酿酒酵母以海藻糖调节渗透平衡的能力高于鲁氏酵母的海藻糖渗透调节能力.     

松香甘油酯聚氧乙烯醚的合成及其性能

研究了松香与甘油的部分酯化反应及松香甘油酯与环氧乙烷的加成反应,得出适宜的反应条件:松香与甘油反应温度为260～270℃,用量配比为1∶2,催化剂ZnO用量为松香用量的0.05%,反应时间4.5h,产物羟值175.2(滴定1g产物所需氢氧化钾毫克数),单酯含量48.2%,双酯含量37%;松香甘油酯与环氧乙烷的加成反应催化剂为KOH,其用量为酯的0.6%,温度150℃。测定了产物松香甘油酯聚氧乙烯醚的表面物理化学性能:表面张力δ为3.29×10-2～3.83×10-2N/m,临界胶束浓度CMC为2.2×10-4～5.2×10-4mol/L,钙皂分散指数LSDP为4.2%～18.5%,对松节油乳化力EP为74～190s,浊点CP为17～81℃;环氧乙烷聚合度(n)对产物表面物理化学性能的影响:随着n的增加,δ先下降,然后逐渐上升,CMC、LSDP、CP逐渐升高,EP先升高,当n=10时,变化趋于平缓。     

过量表达苏氨酸脱水酶对谷氨酸棒杆菌合成L–异亮氨酸的影响

考察过量表达解除反馈抑制的苏氨酸脱水酶对谷氨酸棒杆菌发酵生产L–异亮氨酸的影响.将解除反馈抑制的苏氨酸脱水酶基因ilvA(F383V)连接大肠杆菌/谷氨酸棒杆菌穿梭质粒pXMJ19,过量表达于L–异亮氨酸生产菌株Corynebacterium glutamicum YILW.经5 L发酵罐分批补料发酵产酸实验,与出发菌株C.glutamicum YILW相比,耗糖高峰期滞后,L–异亮氨酸产量增加了10.3%,副产物L–蛋氨酸、L–赖氨酸含量分别降低了33.3%2、6.5%,发酵液中没有L–苏氨酸的累积,乳酸的累积量增加了41.7%.对发酵稳定期的代谢流分布研究表明,过量表达解除反馈抑制的苏氨酸脱水酶使HMP途径流量增加了31.7%,L–异亮氨酸生物合成途径的代谢流提高了8.5%.