睾丸特异表达蛋白质RNF138的表达纯化及抗体制备

目的:制备RNF138的多克隆抗体,为进一步研究其功能奠定基础.方法:通过RT-PCR从小鼠睾丸cDNA文库中扩增mRNF138的开放阅读框,并克隆至原核表达载体pET-30a中;将测序正确的pET-30a(+)/mRNF138重组质粒转化大肠杆菌Rosseta菌株,经IPTG诱导表达后通过镍离子螯合柱(Ni-NTA)...     

西红花酸合成酶（7，8-二加氧酶）片段的克隆及在大肠杆菌中的表达与检测

根据已发表西红花酸合成酶（7,8-二加氧酶）基因序列设计PCR特异性引物,从西红花柱头总RNA中扩增并克隆到一段长为1.2 kb的片段.测序结果表明该片段含有两个序列.一个与已知西红花酸合成酶基因序列高度同源(同源性99％),命名为CsZCD;另一个的同源性为96%,命名为CsZCD-NEW.将CsZCD-NEW片段克隆到表达载体pQE31上,得到重组质粒CsZCD-NEW-pQE31.经IPTG诱导,重组质粒在E.coli M15中表达.     

细胞周期蛋白质依赖性激酶CDK2多克隆抗体的制备和鉴定

我们采用PCR技术合成编码CDK2肽段的基因,将其置于谷胱甘肽转移酶（GST）编码基因的下游,在IPTG诱导下,于E．coli中诱导表达了GST-CDK2肽融合蛋白质,以此融合蛋白质作为免疫原免疫家兔制备抗CDK2的多克隆抗体,经Western Blot检测证明：该抗体能够特异地识别CDK2蛋白质,可作为CDK2的特异性检测抗体,用于研究细胞周期和细胞凋亡进程中CDK2的作用．     

RBM5蛋白的RNA识别区在肿瘤细胞周期调控中作用的研究

为分析RNA识别区(RNA recognition motif,RRM)在RBM5蛋白调控肿瘤细胞周期中的作用,本研究利用低表达RBM5的A549细胞系构建了A549/Vector、A549/RBM5-WT、A549/RBM5-△RRM三种稳定细胞株,通过流式细胞术检测,发现仅有A549/RBM5-WT能显著阻滞细胞于G1期,说明RRM区是RBM5抑制细胞周期进程必不可少的区域.利用Western Blot检测细胞中cyclin A与Phospho-Rb(ser 795)的蛋白水平差异,证明了RBM5蛋白的RRM能够参与其介导的pRb去磷酸化以及抑制cyclin A表达,从而抑制细胞周期进程.     

环氧合酶-2单克隆抗体的制备和初步应用

以合成肽COX-2-KLH为完全抗原免疫BALB/c 小鼠,通过脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合的杂交瘤技术,筛选获得4株(1E10、3D6、5B11、6G4)稳定分泌抗COX-2单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株.采用ELISA的方法鉴定McAb效价、亚型及特异性.各株McAb均属IgG1 亚型,其中1E10腹水纯化后MCAb效价在1∶107以上,SDS-PAGE电泳为单一条带,与同源异构体蛋白不发生交叉反应.获得的McAb被成功应用于COX-2生物学研究中的免疫组织化学(IHC)和Western Blot试验中.本研究获得的单抗具有特异、高效的特点,为COX-2生物学相关研究提供理论依据.