鱼腥藻PCC7120染色体MazEF同源基因对asr0757/alr0758的初步研究

鱼腥藻PCC7120染色体上的基因对asr0757/alr0758,经NCBI比对显示其与大肠杆菌中的毒素-抗毒素基因Maz EF具有较高的同源性,且具有毒素-抗毒素系统基因的保守遗传结构,为研究其是否属于Maz EF家族系统基因,构建同时含有asr0757和alr0758基因的双启动子选择性表达载体,先选择性诱导了该基因对的表达,再验证了其表达产物对细菌生长的影响.结果显示:成功诱导表达出了目的蛋白asr0757(13.5KD)和alr0758(17.5KD),当单独诱导asr0757基因表达时,细菌生长状况不受影响,单独诱导alr0758表达时细菌生长明显受到抑制,同时诱导asr0757和alr0758基因时细菌生长恢复正常,说明asr0757/alr0758构成具有生物功能的Maz EF家族系统基因对,具有毒性与抗毒性功能.     

all 1691基因表达及铁元素对鱼腥藻生长的影响

为实现FurA的表达,探究铁元素对藻生长的影响,首先运用Primer5.0设计引物,克隆出鱼腥藻PCC7120染色体上all1691(furA)基因片段;构建含组氨酸融合表达标签和T7启动子标签的表达载体.IPTG诱导FurA蛋白表达.然后设计不同Fe3+浓度梯度培养基,利用SDS-PAGE检测高、中、低Fe3+浓度培养液的藻细胞总蛋白,考马斯亮蓝g-250法测定蛋白含量,并用Trizol法提取不同Fe3+浓度培养的藻细胞总RNA.结果表明,获得纯化的all 1691克隆片段,大小为456bp,pET-1691重组蛋白在1mmol/L的IPTG诱导下,于37℃下摇床培养15h得到成功表达;低浓度Fe3+促进藻生长,高浓度Fe3+抑制藻生长;Fe3+浓度为2.0mg/L时rRNA位置与亮度清晰可见,而缺铁培养的藻生长几乎停滞,转录和翻译水平都很低.     

鱼腥藻PCC 7120染色体上relBE同源基因的克隆及表达

为研究鱼腥藻PCC7120染色体上与relBE同源的基因asl4561和asl4562表达产物的毒素-抗毒素作用,从鱼腥藻细胞中提取总基因组DNA,设计特异引物PCR扩增目的基因asl4561和asl4562,与T载体连接后经XhoI和EcoR I双酶切并与表达载体pET28a（＋）连接,由IPTG诱导表达,并在IPTG浓度和诱导时间上对asl4561基因的表达条件进行了优化.琼脂糖凝胶电泳显示扩增出了264bp的asl4561基因和213bp的asl4562基因,SDS-PAGE检测表明成功表达出15.65kD和13.55kD的两蛋白,当诱导温度28℃、IPTG浓度0.4 mmol/L、诱导时间6h时,asl4561基因表达蛋白在细菌裂解液上清中表达量最大.     

鱼腥藻PCC7120α质粒上的parD/E同源基因all7155/asl7156的克隆及表达

为研究鱼腥藻PCC7120质粒上毒素抗毒素系统的蛋白质性质和相互作用,根据NCBI中PCC7120的α质粒上的all7155和asl7156基因数据,通过降落PCR克隆了目的基因(all7155/336 bp,asl7156/258 bp).将目的基因片段连接至p MD18-T构建了克隆载体,蓝白斑筛选了阳性克隆,经双酶切纯化后将目的基因连接至表达载体p ET30a(+),并转入表达菌BL21中,测序后证实构建成功,并利用IPTG诱导进行了表达.通过NCBI的BLAST蛋白比对,发现了all7155和asl7156与已知的Par D/E毒素抗毒素系统同源,可通过对此基因的克隆,表达和蛋白性质来进一步认识Par D/E系统.     

Promoter activities of genes cpcT2 and cpcS2 in Nostoc PCC 7120

To study the promoter activities of genes cpcT 2 and cpcS 2,several upstream DNA fragments of these two genes with different lengths were selected.These fragments were fused with promoterless gfp(reporter gene) for constructing five recombinant plasmids.Then,these recombinant plasmids were transferred into Nostoc PCC 7120 by conjugation.The promoter activities of genes cpcT 2 and cpcS 2 were determined by observing the fluorescence of green fluorescent protein(GFP) with a fluorescence microscope.The result showed that the 1 300 bp(-1 300 to 0 bp) and 2 600 bp(-2 600 to 0 bp) upstream fragments of cpcT 2 had strong promoter activity and the promoter activity of the 680 bp(-680 to 0 bp) fragment was weaker than that of two above fragments of cpcT 2.The 2 000 bp(-2 000 to 0 bp) upstream fragment of cpcS 2 revealed weak promoter activity.This showed that a strong promoter of cpcT 2 was located in the upstream fragment between-680 and-1 300 bp.     

人肿瘤坏死因子α在鱼腥藻7120中的表达

通过三亲结合转移方式,将含人肿瘤坏死因子α（ＴＮＦ－α）ｃＤＮＡ和ｐｓｂＡ启动子的鱼腥藻－大肠杆菌穿梭质粒ＰＤＣ－ＴＮＦ导入单细胞丝状鱼腹藻７１２０中。     

Effect of Iron Deficiency on Heterocyst Differentiation and Physiology of the Filamentous Cyanobacterium Anabaena sp. PCC 7120

0　IntroductionIron playsimportantrolesinthemetabolismofcyanobacteria,andisin volvedinavarietyofbiologicalactivities,bothasacofactorandcatalyst.Thesein cludephotosynthesis,pigmentsynthesisandfunction,respiration ,nitrateandnitritere duction ,hydrogenasereactions,dinitrogenfixation,andotherbiologicaloxidations.Numerousstudieshavebeencarriedoutontheeffectofnutritionaldeficiencyoncyanobacteria .Thephysiologicalandmolec ulareffectsofirondeficiencyoncyanobacte riahavebeenstudiedfromavarietyofper sp…     

鱼腥藻PCC7120质粒上毒素-抗毒素基因对alr9029/asr9028的初步研究

指出了大肠杆菌的毒素-抗毒素系统(TAs)能介导解离后致死机制维持细菌质粒的稳定性和参与环境胁迫诱导细菌生长抑制或死亡,在鱼腥藻PCC7120质粒上的基因对alr9029/asr9028具有与TA系统较高的同源性.为了证实该基因对属于TA系统,通过生物信息学分析了alr9029/asr9028的遗传结构,设计特异性引物,扩增得到大小为198 bp的asr9028和387 bp的alr9029.PCR产物经Bam H I和HindШ双酶切后被插入p MD18-T和p ET-30a中,依次构建克隆载体和表达载体.经SDS-PAGE电泳检测,含有His6标签的表达蛋白相对分子量分别为12.4k Da和19.2 k Da,且为可溶性蛋白.故初步认定asr9028为抗毒素基因,alr9029为毒素基因,二者共同构成一个TA系统.     

鱼腥藻铁吸收调节蛋白基因(alr0957)的克隆和表达

依据CyanoBase提供的鱼腥藻PCC7120 furC基因(alr0957)的序列信息设计了一对特异性引物,用Touch-down PCR的方法从基因组DNA中扩增得到大小约450bp的目的片段.通过TA克隆的方法将该片段连接到pMD18-T载体上筛选出重组质粒pMD18-T-fur,然后进行双酶切,纯化furC基因,再连接到原核表达载体pET-28a(+)上,转化表达菌株BL21(DE3).经PCR、双酶切和测序鉴定,对阳性菌株进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测重组蛋白.结果表明:在25℃条件下经1mmol/L IPTG诱导20h,融合蛋白被成功表达,其分子量约为19 000,为进一步纯化蛋白和对基因的调控功能方面研究奠定了基础.