核衣壳蛋白VP39结构分析与杆状病毒的进化研究

在测定了BmNPV—Ch(中国株)和HaMNPV vp39基因序列的基础上，推导出相应的氨基酸顺序，并与AcMNPV、OpMNPV、LdMNPV、BmNPV—Ja(日本株)的VP39蛋白的氨基酸顺序进行了比较。分析结果表明：在已知的各种杆状病毒中，VP39蛋白是一个保守性较强的蛋白质，Bm—NPV—Ch VP39蛋白与AcMNPV、OpMNPV、LdMNPV、BmNPV—Ja和HaMNPV VP39蛋白的氨基酸同源性分别是93．7％、58．2％、39．9％、97．1％、92．8％。HaMNPVVP39蛋白与AcMNPV、OpMNPV、LdMNPV、BmNPV—Ja和BmNPV—Ch VP39蛋白的氨基酸同源性分别为97．3％、59．0%、40．2%、93．1％、92．8％。通过氨基酸亲水性分析比较，探讨了VP39蛋白结构与杆状病毒进化间的关系。     

杆状病毒诱导凋亡昆虫细胞中的线粒体反应和Ca2+的变化

以罗丹明123作为线粒体跨膜电位荧光标记探针, 流式细胞术和激光共聚焦显微镜研究显示, SfaMNPV诱导凋亡的斜纹夜蛾SL-1细胞, 线粒体跨膜电位(∆Ψm)产生明显改变, 病毒接种后4 h, 膜电位开始下降, 随着病毒感染进程的延续, 线粒体膜电位∆Ψm持续降低. 利用Western 杂交分析定位于线粒体的Bcl-2蛋白, 结果表明, 线粒体Bcl-2蛋白含量随病毒感染逐渐减小, 表达水平降低, 病毒感染下调了Bcl-2蛋白的表达. Western杂交检测到显示细胞色素c从线粒体向细胞质中释放, 并在细胞质逐渐积累, 呈时间依赖性特征. 病毒感染诱发的线粒体反应, 提示杆状病毒诱导昆虫细胞凋亡, 可能存在线粒体介导的凋亡信号转导途径. 以Ca²⁺荧光探针Fluo-3/AM负载, 激光共聚焦显微镜观察和荧光分光光度计测定凋亡细胞 [Ca²⁺]_i浓度的变化, 检测到病毒诱导凋亡细胞内的[Ca²⁺]_i浓度明显升高, 细胞外Ca²⁺内流; 在EGTA抑制胞外钙离子内流和细胞质Ca²⁺钳制状态下, PI染色后流式细胞仪检测显示细胞凋亡不受影响, 说明胞质内游离Ca²⁺升高和胞外钙离子内流不是细胞凋亡的主要诱因, 提示内质网钙库Ca²⁺排空可能是SfaMNPV诱导SL-1细胞凋亡信号转导通路中的重要媒介.     

H5亚型禽流感病毒HA基因昆虫/杆状病毒系统的表达及对BALB/c小鼠的免疫保护

经RT-PCR扩增了禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1／96 H5N1亚型1．7kb HA基因的cDNA,将其克隆到pMD18-T中并测序。亚克隆到杆状病毒转移载体pMelBacA的蜜蜂蜂毒素分泌信号下游中,测序正确后与线性化的杆状病毒DNA(Bac-N-BlueTM DNA)共转染Sf9昆虫细胞。将重组杆状病毒感染HFive细胞,72h左右收获细胞,超声波裂解,SDS—PAGE结果表明HA基因在重组杆状病毒感染的HFive细胞中获得表达。蛋白胶薄层扫描分析显示:表达的HA蛋白占重组杆状病毒感染细胞总蛋白含量的17．1％。Western-blot 及血凝实验结果显示,表达的禽流感H5N1亚型病毒HA蛋白具有生物学活性。表达的H5 HA蛋白定量乳化后,皮下多点注射免疫SPF 级BALB/c雌性小鼠,免疫后产生了H5 HA特异抗体,并在三免前后达到并保持较高水平。用致死剂量的HPAIV H5N1攻击小鼠,免疫组小鼠提供了100％的保护力,而对照组小鼠先后发病且死亡:为研制禽流感H5N1亚型病毒亚单位疫苗,防制禽流感奠定了基础。     

几种诱导昆虫细胞RNA干扰质粒的构建和效果比较

构建了四种可以在昆虫细胞中表达形成dsRNA的质粒,比较了其诱导RNA干扰,抑制目标基因———绿色荧光蛋白(GFP)基因表达的效果.四种质粒都不同程度地抑制了质粒介导的GFP表达,其中尤以单个果蝇hsp70启动子表达反向重复序列,并带有杆状病毒AcMNPV增强子hr5的质粒效果最佳,使GFP表达量下降到原来的3.9%.当用于抑制由杆状病毒介导的GFP表达时,以两个相向排列的AcMNPV ie1基因启动子的构造有明显的抑制效果.这些结果对于在昆虫细胞中有效地利用RNA i研究基因功能有参考意义.     

双拷贝v-cath基因的重组AcMNPV的构建与功能

利用AcMNPV穿梭载体Bac-to-Bac系统构建了分别由标状病毒极早期基因iel启动子和极晚期基因ph启动子控制的AcMNPV组织蛋白酶基因v-cath表达的两种双拷贝重组杆状病毒。用这两种重组病毒感染细胞主 幼虫,研究了不同时相v-cath基因的表达及细胞和幼虫死亡的机理。SDS－PAGE和Western blot分析结果表明：在感染Sf9细胞12h后（12hpi),重组病毒dciAcMNPV的晚期基因v-cath在早期基因iel启动了驱动下得到表达。到48hpi,重组病毒dcdAcMNPV中v-cath基因在晚期和极晚期ph启动子驱动下高水平表达,阴性对照v-cath缺陷型病毒（ncAcMNPV)则没有V－CATH蛋白表达。毒力实验表明它们的杀虫活性大小依次为dcdAcMNPV＞dciAcMNPV＞野生型AcMNPV＞ncAcMNPV。根据双拷贝重组病毒的毒力和幼虫的死亡特性,AcMNPV的v-cath基因是一个毒力辅助因子和与虫体液化死亡有关的基因。所构建的重组病毒dcdAcMNPV由于是通过改变病毒自身基因的表达时相和拷贝数而提高了杀虫效率,因而不存在田间释放时的安全性隐患,有望成为一种新型的病毒杀虫剂。     

猕猴B病毒妒和gC合成基因重组杆状病毒质粒的构建

目的构建猕猴B病毒gB和gc合成基因的杆状病毒重组质粒（rBacmid）。方法根据本室已经合成的猕猴B病毒gB基因和gc基因,利用BamHI和XhoI特异性酶切,将其亚克隆于昆虫杆状病毒的pFastBacHTA转座载体。将该阳性转座载体转化到DHlobac感受态细胞,从中筛选出阳性重组细菌,并提取重组质粒。结果获得了重组质粒bacmid—gB和bacmid—gC。结论该研究为猕猴B病毒gB和gc蛋白在杆状病毒系统内的表达奠定了基础。     

白斑综合症杆状病毒的感染途径和宿主种类

利用生物检测、ＰＣＲ、组织病理和电镜技术,通过投喂和浸泡感染方式,结果表明口和消化道是斑节对虾感染白斑综合症杆状病毒（ＷＳＢＶ）的主要途径;宿主经口摄食携带ＷＳＢＶ媒介生物是ＷＳＢＶ传播的主要途径;确定了２１种较大型的ＷＳＢＶ宿主种类,其中以虾蟹为主;桡足类可携带ＷＳＢＶ并起媒介生物的作用     

t-PA在昆虫细胞中的表达

将含完整阅读框架的人ｔ－ＰＡ（ｔｉｓｓｕｅ－ｙｔｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ,ｔ－ＰＡ）ｃＤＮＡ克隆至昆虫细胞表达转移载体ｐＢａｃＰＡＫ８中,获得重组质粒ｐＢａｃ－ｔＰＡ。应用脂质体共转染法,将ｐＢａｃ－ｔＰＡ和线性化杆状病毒ＢａｃＰＡＫ６ ＤＮＡ共转染Ｔｎ－５Ｂ－１昆虫细胞。经空斑筛选获得１１株重组病毒。经ＰＣＲ鉴定与生物活性测定,获得一株高效表达ｔ－ＰＡ的重且病毒ＢａｃｔＰ     

两昆虫杆状病毒诱导的细胞凋亡

首次发现粉纹夜蛾多粒包埋核多角体病毒和中国棉铃虫单粒包埋核多角体病毒分别诱导斜纹夜蛾细胞Ｓｌ－ｚｓｕ－１和纹夜蛾细胞Ｔｎ－５Ｂ１－４发生典型的细胞凋亡。     

人神经营养素-3在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

将人ＮＴ－３基因插入ｐＰＡＫ９中后与Ｂｓｕ３６Ⅰ酶切的Ｂａｃ６昆虫杆状病毒基因组ＤＮＡ共转染ｓｆ２１细胞,以空斑法分离重组病毒。狭缝杂交、细胞免疫化学染色和背根节无血清培养证明ＮＴ－３整合入Ｂａｃ６ＤＮＡ中表达并分泌至胸外。