Jembrana病毒LTR上的AP-4应答元件

通过反义转译实验和凝胶电泳迁移率变动分析, 证实在牛肺细胞中AP-4蛋白可与JDV LTR上的AP-4应答元件直接结合. 对AP-4应答元件进行的一系列定点与盒式诱变证明, JDV LTR上CAGCTG(-65 ~ -60) 6个碱基可能为AP-4的识别序列, 并且每个碱基在AP-4蛋白与DNA结合过程中所起作用的重要程度不同, 当前两位碱基突变为GC时, 对JDV LTR表达功能影响非常明显.     

折质定点诱变技术的进展

蛋白质定点诱变技术是研究基因表达、蛋白质结构与功能关系，蛋白质的稳定性及分子进化等的重要工具。已发展了大量诱变质粒ＤＮＡ特殊碱基的有效操作程序。所有的方法都按在体外用带有预先设计诱变部位的寡核苷酸与已知序列靶基因序列错配异源杂交、合成定点诱变的ＤＮＡ完成的。对具有代表性的Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ法、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｐｒｏｍｅｇａ法、Ｄｅｎｇ和Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ法进行了综述，并讨论了它们的优点和局限性。     

阿特拉津氯水解酶基因的定点诱变和酶活力检测

阿特拉津氯水解酶(AtzA)是一种对除草剂的生物降解和环境净化有重要意义的酶．采用定点诱变方法将假单胞菌ADP株的atzA基因第832位碱基(鸟嘌呤)诱变成腺嘌吟，然后将其插入表达载体pET21b( )，并在大肠杆菌中表达．表达的蛋白特性研究表明：AtzA或AtzA—NK融合蛋白系水溶性蛋白，很容易通过Ni—NTA Magnetic Agarose Beads分离纯化．采用阿特拉津脱氯反应产生HCl而引起pH指示剂颜色改变的测定方法能方便地对其酶活力进行定量．酶活力结果表明，突变酶的比活力与假单胞菌ADP菌株的AtzA相比没有明显改变，暗示突变位点(第278位缬氨酸突变成甲硫氨酸)不是酶的活性中心或底物结合部位。     

血管生长素衍生物His13Gly的基因工程研究

在人工合成的血管生长素基因的基础上，利用化学合成的寡聚核苷酸片段，采用掺Ｕ法对ＡＮＧ知性定位眯诱变，同位素杂交筛选到ＡＮＧ基因的衍生物ＩＳ１３Ｇｌ６突变子。     

限制性核酸内切酶PvuⅡ识别序列外甲基化抑制其酶切活性的分子机理研究

DNA甲基化是DNA分子上重要的碱基修饰方法之一,它可以影响核酸的结构及其与蛋白质的相互作用,由此影响基因的表达,关于甲基化与限制性核酸内切酶之间的关系,以往的研究表明:限制性核酸内切酶识别序列内DNA甲基化可特异性地抑制该酶的酶切活性。     

P137G点突变对嗜热细菌木糖异构酶酶活性及热稳定性的影响

利用重叠延伸法对嗜热细菌（Thermus thermphilus）的木糖异构酶基因xylA进行体外P137G定点突变，通过酿酒酵母表达载体XM204将突变基因xylA137引入酿酒酵母H158中，得到重组菌株H158 XI137. 酶活分析表明，H158 XI137在中温条件下的酶活有很大的提高，与对照菌株H158 XI相比，30?℃时的酶活提高1倍，并且拓宽了最适反应pH，但是其热稳定性大大降低. 结果表明，嗜热细菌木糖异构酶137位的Pro对维持其热稳定性起到重要的作用，并且对其酶学性质有很大的影响.     

xyl-d二型乙醇脱氢酶(SADH)G198R突变体的研究

本研究通过设计简并引物及文献参考,PCR 克隆得到嗜热厌氧菌菌株 xyl-d 的SADH,并利用定点诱变技术将该酶的198位苷氨酸(Gly)突变为精氨酸(Arg)。将野生型和突变基因连接到原核表达载体pET28a,IPTG诱导表达,再经镍柱纯化,然后比较了两个蛋白分别以 NAD/NADH,NADP/NADPH 为辅因子、异丙醇或异丁醛为底物、55℃条件下的酶活。发现突变后蛋白的总体催化活性相对于野生型有所下降,其中突变蛋白对 NAD/NADH 的亲和性分别下降了约8倍和6倍,而且对NADPH 的亲和性下降也非常明显,但对NADP的亲和性变化却不大。     

抗菌肽Protegrin基因的定点诱变改良研究

通过对抗菌肽Protegrin成熟肽的氨基酸组成和作用机理分析,并根据已报道的Protegrin基因序列设计引物,PCR扩增获得定点诱变的突变体基因pg-g,其编码蛋白的末端相对于野生型增加1个非极性氨基酸Gly.利用表达载体pET-28a将突变体基因pg-g转化到大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达后,经SDS-PAGE检测表明目的蛋白得到成功表达.通过对表达产物进行抑菌实验发现,定点突变基因pg-g表达产物对大肠杆菌的抑菌效果有明显提高.     

杆状病毒P49蛋白的Caspase切割位点的鉴定

海灰翅夜蛾核型多角体病毒(SlNPV)的p49基因, 可抑制病毒感染引起的昆虫细胞Sf 9的凋亡. 用杆状病毒Bac-to-Bac表达系统表达的P49蛋白可抑制Caspase的活性. 通过氨基酸序列测定发现, P49蛋白的91 ~ 95位的氨基酸序列是⁹¹TVTDG⁹⁵. P49蛋白在体外可被人及家蚕Caspase切割, 切割后均产生约10和40 kD的2个片段. 经定点诱变得到的P49蛋白94位氨基酸突变体不能被人及家蚕Caspase切割, 同时也失去对Caspase的抑制功能. 而91位突变体蛋白仍可被Caspase切割, 并保留了对Caspase 抑制的部分活性. P49蛋白不仅作用于下游的效应Caspase, 也可作用于上游的启始Caspase, 它是一个广谱的Caspase抑制剂.     

蛋白质定点诱变技术的进展

蛋白质定点诱变技术是研究基因表达、蛋白质结构与功能关系，蛋白质的稳定性及分子进化等的重要工具．已发展了大量诱变质粒DNA特殊碱基的有效操作程序，所有的方法都按在体外用带有预先设计诱变部位的寡核苷酸与己知序列靶基因序列错配异源杂交、合成定点诱变的DNA完成的．对具有代表性的Hutchison法、Kunkel法、Promega法、Deng和Nickoloff法进行了综述，并讨论了它们的优点和局限性．