甘蓝磷酯酶D HKD2功能区基因片段的克隆与反义表达载体的构建

以甘蓝(Brassiaca oleracea)为材料，取幼叶分离mRNA，反转录合成cDNA，以cDNA第一链为模板，通过PCR扩增，获得甘蓝磷酯酶D(Phosphorate　Lipid　Dehydrolase，PLD)HKD2功能区的基因片段．对其进行Blast分析，结果表明，分离的目的片段核苷酸序列与Genbank中报道的甘蓝PLD基因相比同源率为99．7％，只有2个碱基发生改变．将得到的PLD基因片段插入植物表达载体pAT940，构建了PLD基因反义表达载体pATC—rPLD，为下一步进行抗逆转基因作物选育打下基础．     

分子生物学新技术—反义技术

反义技术是近年发展起来的一种分子生物学新技术。它根据核酸杂交原理设计针对特定靶序列的反义核酸,从而抑制特定基因的表达,目前包括反义RNA、反义DNA和核酶三大技术。该技术的研究具有重要的理论意义和实际意义。     

利用安全性转基因技术导入反义蜡质基因降低稻米直链淀粉含量

利用安全性转基因技术中的共转化法, 将分别含有p13W₄双元载体(含有潮霉素抗性基因、gus报告基因以及反义蜡质基因片段)和p13W₈双元载体(无潮霉素抗性基因和gus报告基因, 只含有反义蜡质基因片段)的根癌农杆菌以1:9的比例混合导入超2-10高产水稻新品系中, 获得34棵转基因植株. PCR分析转基因T₀代植株, 结果显示, 有15株是共转化植株, 共转化率为44.1%. 利用p13W4双元载体上的gus报告基因从T₁代种子中淘汰具有报告基因及抗性标记基因的转基因后代, 再利用PCR检测从T₁代植株中获得只有反义蜡质基因的植株. Southern blot杂交分析证实, p13W₈双元载体T-DNA已整合进入无抗性标记及报告基因的转基因后代基因组中. T₂代成熟种子直链淀粉含量分析显示, 转基因植株糙米直链淀粉含量比对照有不同程度的下降, 幅度最大的比对照降低28.61%. 由于获得的转基因后代只有目的基因而无抗性选择标记基因和报告基因, 而且水稻中的稻米直链淀粉含量已降低, 它们既可被用于筛选软米材料, 也可视为是能够用于其他水稻稻米食味品质改良的水稻新资源.     

聚乙烯亚胺介导生存素反义核酸体外投递肝癌SMMC-7721细胞的条件优化

目的:探讨聚乙烯亚胺(polyethylene im ine,PEI)作为生存素(survivin)反义核酸(anti-sense oligodeoxynuc leotides,ASODN)的载体投递肝癌SMMC-7721细胞的条件。方法:凝胶阻滞实验筛选PEI与survivin ASODN形成静电复合物的最佳质量比;W ST-8法检测PEI对肝癌细胞的毒性;流式细胞仪及W ST-8法筛选荧光标记的PEI与ASODN在不同质量比时的瞬时转染效率及48 h转染效率;流式细胞仪及荧光显微镜分别检测荧光标记的ASODN以及PEI-ASODN复合物进入细胞的情况;W ST-8法检测血清对PEI转染效率的影响。结果:m(PEI)∶m(ASODN)为0.625∶1~2.5∶1时可以形成电中性状态的静电复合物;PEI终质量浓度≤4μg/mL对肝癌细胞的毒性较小;m(PEI)∶m(ASODN)为0.75∶1时转染效率最高;血清存在对PEI转染效率无明显影响。结论:PEI是一种低毒的ASODN投递载体,其终质量浓度≤4μg/mL可作为肝癌细胞的转染载体,血清条件下m(PEI)∶m(ASODN)为0.75∶1时,PEI携带sur...     

乙烯调控果实成熟的分子生物学研究进展

乙烯是一种可促进果实成熟的内原植物激素．随着分子生物学的发展，已克隆出几个与乙烯合成有关的果实成熟基因，并获得了反义基因转化植株。本文简要综述了用基因工程手段调控果实的成熟，基因工程技术对认识果实成熟机理的贡献，以及乙烯调控果实成熟的分子机理．     

水稻基因表达谱分析寡核苷酸芯片制备的研究

 首先有目的地搜集了50个水稻花序相关基因,进行了探针的设计、筛选及合成纯化,用点样仪以微阵列的形式将其点于醛基化的玻璃片上;将3个不同生长阶段的水稻花序材料的总RNA经荧光标记反转录后与寡核苷酸芯片进行杂交.用ScanArray3000对获得的表达谱进行扫描分析显示,芯片图像背景均匀,信号清晰.用ImaGene4.0软件对表达谱分析表明,候选基因在水稻花序3个不同发育阶段的材料中,表达水平有显著差异.为进一步进行水稻寡核苷酸芯片的制备及应用奠定了基础.     

反义核酸Ⅷ C真核表达载体的构建及其对转化血管内皮细胞的影响

利用人工合成的部分反义核酸ⅧC(以pⅧC表示)用以构建含有部分反义凝血因子基因片段的真核表达质粒pXJ41-neo/pⅧC,再用磷酸钙介导转染血管内皮细胞,筛选出阳性克隆血管内皮细胞,扩大培养转基因细胞,用金黄色葡萄球菌凝集试验和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测转基因细胞ⅧC蛋白质的表达水平.结果表明所构件人工合成的部分反义核酸pⅧC真核表达载体能有效抑制人的凝血因子ⅧC的表达,因此建立了有效表达反义核酸pⅧC的血管内皮细胞模型.     

利用椭圆偏振光谱法研究硅片上DNA分子杂交

将单晶硅片硅烷化后，用戊二醛做醛基修饰，将5′端氨基修饰寡核苷酸探针片段通过醛－氨共价键结合在硅片上，然后用椭圆偏振光谱法对探针和不同序列样品的杂交反应进行了研究。结果表明该方法能在不对样品进行荧光标记的情况下直接研究杂交反应的效率，从而得知样品的序列信息。     

合成U3snRNA基因上游启动区构建ACC合成酶反义RNA-核酶嵌合基因的植物表达载体

利用反义 RNA和核酶进行基因表达调控是当今植物分子生物学的研究热点之一 .但在转基因植物中 ,利用 RNA聚合酶 型启动区表达效率不高 .番茄 U3sn RNA基因由 RNA聚合酶 来转录 ,具有较高的转录效率 ,为一般转录效率的 1 0 0～ 1 0 0 0倍 .我们人工合成了番茄 U3sn RNA基因上游启动区 ( 1 5 2 bp) ,构建到番茄 ACC合成酶的反义 RNA-核酶嵌合 DNA序列的上游 ,然后将“启动区 -反义 RNA-核酶嵌合 DNA序列”插入到植物双元表达载体p GA6 4 3中 ,并用三亲融合法导入农杆菌 LBA4 40 4中 ,为研究 U 3sn RNA上游启动区增强反义 RNA-核酶基因的表达奠定了基础