豌豆AGAMOUS同源基因功能的初步研究

豌豆是研究植物发育遗传的经典模式植物. 虽然已经克隆到了一些与豌豆花发育有关的基因, 但是由于豌豆基因组大、序列信息少以及缺少有效的遗传转化方法, 豌豆花发育研究的发展受到了限制. 病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing, VIGS)技术是近年来发展起来的一种反向遗传学快速研究基因功能的方法. 本文利用基于豌豆早褐病毒 (pea early browning virus, PEBV)的VIGS体系研究了豌豆中AGAMOUS同源基因(Pisum sativum AGAMOUS homologous genes, PsAGs)的功能. 在PsAGs沉默之后, 豌豆花表现为雄蕊花瓣化, 心皮开裂, 内生出一朵不完整的花. 半定量RT-PCR分析结果显示, 在沉默植株中PsAGs的mRNA转录水平显著下降. mRNA原位杂交结果显示, 花发育早期, PsAG基因在花原基中央表达, 后期在第三、四轮花器官中表达, 表明在豌豆有多个AGAMOUS同源基因. 实验结果表明, 豌豆中可能存在多个AGAMOUS同源基因, 彼此间功能冗余且相对保守, 同时暗示着在对基因家族成员进行功能研究时, VIGS是有效手段之一.     

小麦SBEⅡb基因的克隆及其与PDS基因串联VIGS载体的构建

为探讨以PDS基因为指示基因利用VIGS技术研究小麦SBEⅡb基因的功能,本研究拟构建小麦SBEⅡb和PDS的双基因串联VIGS重组载体。根据GeneBank中公布的小麦SBEⅡb(AY740401.1)和PDS(FJ517553.1)基因序列分别设计搭桥引物,利用RT-PCR技术克隆SBEⅡb和PDS基因的特异片段,利用SOE-PCR技术获得双基因融合片段SBEⅡb:PDS。然后以BSMV:γ-PDS为原载体,通过酶切连接,用SBEⅡb:PDS基因片段将原载体中的PDS基因片段进行替换,从而构建BSMV:γ-SBEⅡb:PDS重组载体。结果显示克隆的SBEⅡb和PDS基因片段长分别是181和190 bp,SBEⅡb:PDS片段长是370 bp。序列分析表明:SBEⅡb基因片段与小麦SBEⅡb(AY740401.1)序列同源性为97%;小麦PDS基因片段与PDS(AF155217.2)序列同源性也为97%;酶切鉴定结果表明成功构建BSMV:γ-SBEⅡb:PDS重组载体。本研究构建的BSMV:γ-SBEⅡb:PDS重组载体将在PDS基因的指示下为下一步利用VIGS技术在小麦上研究SBEⅡb基因与小麦淀粉合成的关系奠定了基础。     

病毒诱导基因沉默—植物抗病的可能机制

植物抗病性是植物的一种属性,植物对病原体的抗性可以通过诱导产生,本文首先介绍了几十年来植物抗病性的研究进展,进而从病毒诱导基因沉默（Virus-induced gene silencing,VIGS)的遗传学和分子生物学角度对植物抗病性进行了探讨,指出病毒诱导基因沉默是植物抗病的可能机制,同时为功能基因组学的研究探索出一条有效的研究方法。     

1个Avr／Cf介导的差异表达基因在番茄抗叶霉病中作用的基因沉默分析

Avr／Cf介导产生过敏性反应时特异表达的cDNA—AFLP片段，称为ACE（Avr／Cf—elicited）片段，从中挑选1个未知功能的基因（记为ACE5）（GeneBank登录号为CK348288），利用VIGS技术对该片段相应基因进行基因沉默分析，分析该基因在植株生长和发育以及番茄抗叶霉病中的作用。结果表明该差异表达片段相应基因对本氏烟的生长发育以及Avr／Cf介导的HR反应均无影响。     

山桐子IpSAD基因家族分析及功能鉴定

【目的】硬脂酰-ACP Δ⁹脱氢酶(stearoyl-ACP Δ⁹ desaturase,SAD)是决定脂肪酸组成的关键酶,分离和鉴定木本油料植物山桐子(Idesia polycarpa)的SAD基因,可为遗传改良山桐子油的脂肪酸组成提供基因资源。【方法】 使用 HMM 和 Blastp 鉴定山桐子全基因组中的SAD家族成员;利用MEGA X、MEME和PlantCare等在线软件对其蛋白质理化性质、系统发育关系、基因结构、保守基序和启动子顺式调控元件等进行分析;使用MCSCANX分析山桐子和毛果杨SAD基因之间的共线性关系;基于RNA-seq数据,分析IpSAD各成员的表达模式,通过病毒诱导的基因沉默技术(virus induced gene silencing,VIGS)快速验证它们的生物学功能。【结果】 ①在山桐子基因组中共鉴定到7个IpSAD基因(IpSAD1~7),多重序列比对结果显示各成员间序列相似度较高且结构域保守;②系统发育分析表明,IpSAD成员可以分为3个亚组,与拟南芥SAD家族的分类结果一致,拟南芥单不饱和油酸合成关键基因AtSSI2与山桐子IpSAD2、IpSAD3、IpSAD4的亲缘关系较近;③启动子区域顺势调控元件预测结果显示IpSAD基因的启动子含有光反应、脱落酸响应等顺式调控元件;④IpSAD基因按其组织表达模式可分为3类,第1类和第2类成员在大部分组织中表达量较低,而第3类成员在所有组织中表达量均较高。⑤沉默IpSAD基因使叶片的油酸含量显著降低,其中IpSAD3的沉默可使油酸含量下降76%。【结论】 明确了IpSAD家族各成员的基本特征,确定了它们对于油酸合成的生物学功能,并为山桐子油脂生物合成调控机制研究奠定了基础。