从噬菌体抗体库中淘选人绒毛膜促性腺激素的单链抗体

由鼠源噬菌体抗体库淘选到展示有人绒毛膜促性腺激素单链抗体的噬菌体克隆。用ELISA方法进行检测,从结合力最强的克隆中分离单链抗体基因,插入经改造的高效表达载体pET-21a(+)中,转化大肠杆菌,诱导表达。从培养基中可检测到可溶性抗人绒毛膜促性腺激素的单链抗体。     

小鼠噬菌体抗体库的构建和N-肽结合单链抗体的筛选

成功构建一库容量为1.7×10⁸的小鼠噬菌体抗体库,并从中淘选出对N-肽有结合活性的单链抗体。首先从未免疫小鼠的脾脏中提取总RNA,分离出mRNA,经逆转录合成其总cDNA。随后通过PCR分别扩增出抗体重链和轻链可变区V_H、V_L的基因片断,再经重组PCR将两片断由一编码(Gly₄Ser)₃十五肽的接头连在一起,并克隆到噬菌质粒pCANTAB 5E中,电击转化大肠杆菌TG1。经辅助噬菌体M13KO7超感染回收全部重组噬菌体,此即噬菌体抗体库。N-肽是一种新发现的神经肽,其N端与阿片肽高度同源,可与阿片肽受体相互作用。对其研究可能有助于了解成瘾机制和有临床应用价值。将生物素化的N-肽与抗体库相互作用,用偶联有链霉亲和素的磁珠富集与N-肽结合的重组噬菌体,经四轮淘选,得到亲和力较高的单链抗体。     

含RGD序列水蛭素嵌合抗栓剂的构建与表达

通过对水蛭素及一些含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列的多肽类血小板聚集抑制剂结构与功能的分析,设计并构建了两个在水蛭素C端融合RGD序列的嵌合分子。嵌合体基因分别重组到表达载体pET-21a(+)中并转化大肠杆菌BL21(DE3)。经限制酶消化和DNA序列分析,证明两种重组质粒与设计完全一致。由于RGD-水蛭素嵌合基因上游连接了金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)的信号肽序列,在IPTG诱导下两种嵌合分子都获得了分泌表达,表达产物主要集中在细胞周质空间。通过离子交换层析和凝胶过滤层分别对两种嵌合体蛋白进行纯化,纯化产物在Tricine-SDS-PAGE中都显示为单一条带。活性分析结果表明两种嵌合体蛋白在保留水蛭素抗凝血酶活力的同时,还呈现抗血小板聚集活性。     

ICAM-1特异结合肽的淘选与性质研究

利用噬菌体展示载体pCANTAB5G8构建了随机十五肽库,根据转化率计算库容量为1.36×108.用PCR-SSCP检验了库的异质性.以固相包被亲和淘选的方法,经过4轮淘选和ELISA分析,得到了5个可与重组人细胞间粘附分子1(ICAM-1)特异结合的噬菌体克隆,对所展示的十五肽进行了序列分析.其中活性较高的噬菌体展示十五肽与ICAM-1的亲和常数约为7.87 ×107.     

水蛭素基因的递归PCR合成和在大肠杆菌中的表达与分泌

水蛭素是凝血酶最强的特异抑制剂，可望成为预防和治疗各种血栓疾病的有效药物。根据医用水蛭头部水蛭素（ＨＶ－２）的氨基酸序列，通过递归ＰＣＲ，合成水蛭素基因，并重组到本实验室改建的大肠杆菌分泌型表达载体ｐＩＮ－＝ｏｍｐＡ－ＨＩ中，使水蛭素基因的编码序列直接位于大肠杆菌外膜蛋白Ａ信号肽序列的下游。转化大肠杆菌ＤＨ５α，筛选出重组体，经ＰＣＲ，限制酶切图谱和序列分析，结果表明所合成的水蛭素基因与设计完全一     

噬菌体单链抗体导向溶栓剂的构建

Fibrin\|specific antibodies were isolated from a phage\|displayed single\|chain antibody(ScAb) library using affinity selection or panning.DNA shuffling was introduced to realign the specific antibody genes in order to mimic the antibody maturation in vivo. After cloning of shuffling products,a secondary library was constructed,from which the specific antibody against fibrin with higher activity was selected through panning and screening.The fibrin\|specific antibody gene and uPA functional domain gene fragment were joined together,then inserted into expression plasmid pET\|21a.The ScAb/uPA fusion protein was expressed with the induction of IPTG.In substrate S 2444 assay,the uPA activity of the chimera was about 3.1×10 3?IU/mg periplasmic protein of host E.coli .It also kept up the affinity to fibrin.     

腺病毒介导MTS1的抑癌作用

人多肿瘤抑制因子（MTS1）是一个抑瘤基因,在许多原发性肿瘤及细胞系中都发现了它的突变,有潜在应用价值。由于腺病毒独特的性质,它介导的肿瘤基因置换疗法,受到了愈来愈多的应用与关注。人癌胚抗原启动子能指导组织特异性表达。将癌胚抗原启动子置于MTS1基因上游,并在下游加poly A化信号,通过穿梭质粒pΔE1SP1A在人胚肾细胞HEK 293中与腺病毒载体pBHG11进行同源重组,插入腺病毒E1区。获得的重组病毒粒子作用于人乳腺癌细胞系MCF7,初步表明重组腺病毒能抑制MCF7的生长。