微生物发酵法生产聚β-羟基丁酸

真养产碱菌（Ａｌｉｃａｌｉｇｅｎｅｓｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）Ｍ４０５可以利用葡萄糖生产聚β－羟基丁酸（ＰＨＢ）。对真养产碱菌Ｍ４０５的营养性能以及ＰＨＢ的定性、定量检测进行了研究，并对培养基进行了优化。结果表明，ＰＨＢ经苏丹黑Ｂ梁色呈蓝黑色，它可以用氯仿抽提法提纯，在２３５ｎｍ分光光度计检测。真养产碱菌Ｍ４０５在氮源（（ＮＨ４）２ＳＯ４）达２ｇ·Ｌ－１时，经补料式一步培养后，葡萄糖转化率达到２６９％，此时ＰＨＢ含量最高。     

假丝酵母类金属硫蛋白的分离、纯化及功能研究

假丝酵母Cu-12(Candida sp．Cu-12)经Cu^2 诱导产生的蛋白进行Sephadex G-100和纤维素DE-52分离纯化及理化性质测定，获得的蛋白具有四个亚型，其主理化性质均与MT的定义相符，因此确定得到了假丝酵母的类金属硫蛋白，同时测定了该Cu—MT清除羟自由基和氧自由基的能力．     

深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因敲除及鉴定

以产油丝状真菌深黄被孢霉M6-22(Mortierella isabellina 6-22)为出发菌株,利用亚硝基胍诱变技术筛选到一株对潮霉素药物敏感的菌株Mortierella isabellina 6-22-4,同时构建了含有潮霉素抗性基因表达单元和深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因5'与3'端部分同源序列的重组质粒PD4MI6,用于对深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基鼠的敲除.通过PEG/CaCl2介导的原生质体转化法,将质粒PD4MI6转化入深黄被孢霉M6-22-4菌株.转化子经潮毒素抗性选择平板筛选、分子检测获得了一个△6-脂肪酸脱氢酶基因缺失的突变株Mut6.气相色谱分析结果显示,该突变株γ-亚麻酸特征峰消失,相应地亚油酸产量显著增加.培养结果表明该突变株的菌落形态、颜色及生长状况与出发菌株M6-22或M6-22-4相比均有显著改变.     

高山被孢霉Δ~6-脂肪酸延长酶基因在巴斯德毕赤酵母中的表达

长链多不饱和脂肪酸花生四烯酸(ARA,C20:4n-6)是合成生物活性物质类二十碳烷酸的初级底物神经组织的重要组成成分.Δ6-脂肪酸延长酶是花生四烯酸Δ6-合成途径的关键酶之一.根据已经报道的Δ6-脂酸延长酶基因序列设计引物,分别从产花生四烯酸的丝状真菌高山被孢霉ATCC16266菌株基因组和cDNA扩增得到该序列.经序列分析后,将来源于cDNA的序列连接到毕赤酵母表达载体pPIC3.5K上,得到重组质PIC3.5K-ELO.用电击转化法将重组载体pPIC3.5K-ELO转化到巴斯德毕赤酵母GS115中,在缺省培养基筛选得到毕赤酵母转化菌株pPIC3.5K-ELO.在适宜的培养条件下,添加外源底物γ-亚麻酸(GLA)和诱导物醇诱导基因表达.气相色谱分析表明该基因在毕赤酵母中得到了表达,底物GLA转化为二高γ-亚麻酸GLA),转化效率为28.91%.对Δ6-脂肪酸延长酶进行跨膜分析,表明该蛋白为具有7个跨膜域的膜结合蛋白.     

△6-脂肪酸脱氢酶的系统进化分析

将已报道的△6-脂肪酸脱氢酶基因所编码的氨基酸序列进行比较,推断它们的系统进化关系.分析结果显示的△6-脂肪酸脱氢酶氨基酸序列都具有3个高度保守的组氨酸富集区,表明它们具有共同起源,并分为原核、动物、高等植物和低等真核4个类型.推测原核类型的△6-脂肪酸脱氢酶是所有△6-脂肪酸脱氢酶的共同祖先,真核类型的△6-脂肪酸脱氢酶在后来的进化中形成更具选择优势的细胞色素b5融合蛋白.动物类型的△6-脂肪酸脱氢酶处于真核类△6-脂肪酸脱氢酶的最基础分枝,其中鱼类的△6-脂肪酸脱氢酶可能是动物类型的△6-脂肪酸脱氢酶通过序列改变向△5-脂肪酸脱氢酶进化的中间过度形式.高等植物和真菌类型的△6-脂肪酸脱氢酶存在着共同起源,藻类和苔藓可能在高等植物和真菌类△6-脂肪酸脱氢酶的进化关系上扮演着重要的角色.线虫的△6-脂肪酸脱氢酶作为一个独立而且最基础的分枝位于低等真核单系组中,它可能是一种趋同进化的结果.     

抗铜酿酒酵母铜结合蛋白的纯化及性质研究

酿酒酵母Ｃｕ＾２＋抗株ＹＮＤ２１经含一定浓度的氯化铜培养基诱导培养后,收集菌体,破碎细胞,离心后ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０和ＤＥＡＥ－ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ柱层析分离可获得三种铜结合蛋白ＤＥ－１,ＤＥ－２,ＤＥ－３。ＤＥ－１脱盐后（Ｇ－１）经鉴定具有金属硫蛋白的特性：表观分子量约为１８ｋＤ;每分子蛋白含２０个巯基,结合１１个铜原子;氨基酸组成中富含半胱氨酸（１８％）、碱性和酸性氨基酸,而酪氨酸和蛋氨酸含     

Δ^6-脂肪酸脱氢酶的系统进化分析

将已报道的Δ6-脂肪酸脱氢酶基因所编码的氨基酸序列进行比较,推断它们的系统进化关系.分析结果显示的Δ6-脂肪酸脱氢酶氨基酸序列都具有3个高度保守的组氨酸富集区,表明它们具有共同起源,并分为原核、动物、高等植物和低等真核4个类型.推测原核类型的Δ6-脂肪酸脱氢酶是所有Δ6-脂肪酸脱氢酶的共同祖先,真核类型的Δ6-脂肪酸脱氢酶在后来的进化中形成更具选择优势的细胞色素b5融合蛋白.动物类型的Δ6-脂肪酸脱氢酶处于真核类Δ6-脂肪酸脱氢酶的最基础分枝,其中鱼类的Δ6-脂肪酸脱氢酶可能是动物类型的Δ6-脂肪酸脱氢酶通过序列改变向Δ5-脂肪酸脱氢酶进化的中间过度形式.高等植物和真菌类型的Δ6-脂肪酸脱氢酶存在着共同起源,藻类和苔藓可能在高等植物和真菌类Δ6-脂肪酸脱氢酶的进化关系上扮演着重要的角色.线虫的Δ6-脂肪酸脱氢酶作为一个独立而且最基础的分枝位于低等真核单系组中,它可能是一种趋同进化的结果.     

少根根霉△12-脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中的表达

为探讨采用转基因的方法将毕赤酵母改造为产多不饱和脂肪酸菌株的可行性,将来自于丝状真菌少根根霉的△12-脂肪酸脱氢酶基因与毕赤酵母的胞内表达载体pPIC3.5K连接构建了重组表达载体pPICRAD12,经Sac I线性化后电击转化毕赤酵母菌株GS115获得转基因酵母菌株PICRAD12.PCR鉴定结果表明,目的基因已经整合到毕赤酵母基因组中.经甲醇诱导表达后,通过气相色谱和气相色谱和质谱连用的方法分析转基因毕赤酵母的脂肪酸成分表明,转基因毕赤酵母的亚油酸含量增加了4.5%,说明了可以通过增加△12-脂肪酸脱氢酶基因的拷贝数或者使用强启动子的方法来增加亚油酸的含量,为将毕赤酵母改造为产多不饱和脂肪酸的基因工程菌株进行了有意义的探索.     

富硒酵母的筛选

对 5属 7种 30株酵母菌进行了富硒酵母的筛选 ,经过抗性筛选和摇瓶发酵培养获得 NK2和NK4两株富硒菌株 ,在 YEPD培养基 ,培养 2 0 h加硒 ,4 8h收获 ,富硒菌株的含硒量达到 80 0 μg/g干菌体。     

酿酒酵母中少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶对α-亚麻酸催化活性的研究

多不饱和脂肪酸(po lyunsaturated fatty ac ids,PU FA s)可分为n-6和n-3两个系列,而Δ6-脂肪酸脱氢酶是这些PU FA s合成途径中的限速酶.将少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因转化酿酒酵母营养缺陷型菌株INV S-cl,在添加外源性底物α-亚麻酸,经半乳糖诱导后,通过气相色谱(GC)和气相色谱/质谱(GC-M S)联用分析细胞脂肪酸表明,少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶催化α-亚麻酸转化成十八碳四烯酸,所生成十八碳四烯酸的含量占酵母细胞总脂肪酸的7.67%,而在空载体pYES2.0转化的酵母中没有检测到.同时,参照K ozak序列,我们把少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的转译起始密码子周边序列进行适当的改变,并转化INV Scl进行分析,结果显示修改后的序列同样能催化α-亚麻酸转化成十八碳四烯酸,而且表达量提高到细胞总脂肪酸的11.23%,表明在酿酒酵母中,改变转移起始密码子周边序列可提高少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因催化α-亚麻酸转合成十八碳四烯酸的水平.