北京棒杆菌天冬氨酸激酶突变体P184Q的酶学性质表征

通过分析谷氨酸棒杆菌天冬氨酸激酶(AK)的结构,筛选可能影响别构抑制剂结合的Pro184位点,对其进行饱和定点突变,成功筛选出突变菌株P184Q.酶学性质研究表明:突变体P184Q的V_(max)比野生型(WT)提高了3倍;n=1.39,低于WT的值(2.6),正协同性下降,同时Km值减小,对底物的亲和力增大;P184Q最适pH=6.5,最适反应温度为25℃,半衰期为2.8h;P184Q对金属离子和有机溶剂均表现出良好的抗性,解除抑制剂苏氨酸和甲硫氨酸、赖氨酸和甲硫氨酸、苏氨酸和赖氨酸、赖氨酸对酶活力的抑制作用.     

嗜热酯酶EstTs1的远源三维结构模建及分子对接

利用Phyre网络服务器,构建嗜热酯酶EstTs1的三维结构,并通过分子动力学优化构型,得到了可靠的构型.分子对接研究表明,p-硝基苯基丁酸酯是EstTs1的最适底物,其大小正适合EstTs1的活性口袋.Thr111是底物与酶结合的重要残基,与底物形成了氢键; Ser85是重要的催化残基.     

角鲨烯合成酶抑制剂的高通量虚拟筛选

以SQS抑制剂CP 320473为先导物, 在60%结构相似性的基础上, 先通过AutoDock Vina软件进行分子对接, 再选取结合能量最低的新化合物进行分
子对接研究. 结果表明： zinc_8442249比先导化合物CP 320473的抑制效果更好; SQS活性位点的Lys52通过与氢键与抑制剂结合, 在抑制过程中具有重要作用.     

北京棒杆菌天冬氨酸激酶突变体A380H的酶学性质

同源序列比对和蛋白质结构分析表明,A380为天冬氨酸激酶(aspartate kinase,AK)的绝对保守位点,对该位点进行定点突变、分离纯化和性质表征.结果表明:与野生型(WT)相比,突变体A380H的V_(max)提高4.28倍;突变体A380H的最适温度由28℃提高至35℃,最适pH值仍为7.5,半衰期由4.5h缩短至3.5h;底物抑制剂对WT和突变体均有抑制作用,苏氨酸和赖氨酸呈协同抑制作用,苏氨酸单独存在时对A380H具有激活或抑制减弱作用;Mg~(2+),Ni ~(2+)对WT有激活作用,1,5mmol/L的Cu~(2+)对A380H有激活作用;与WT相比,甲醇和异丙醇对A380H的抑制作用增强,正丁醇和乙腈对A380H的抑制作用减弱且表现出激活作用.     

北京棒杆菌天冬氨酸激酶M372I-T379S双突变体的构建及其酶学性质

为构建高酶活力天冬氨酸激酶(aspartokinase, AK), 并削弱或解除Lys(lysine)反馈抑制作用突变体, 通过定点突变和高通量筛选技术构建突变体M372I,T379S和M372I-T379S, 对野生型（WT）和突变体分别进行诱导表达、 纯化及酶学性质表征. 结果表明： 突变体M372I,T379S和M372I-T379S AK与WTAK相比, V_max分别提高了13.77,15.02,15.60倍, K_m和n值均降低； 最适pH值分别升高为8.0,8.5,8.5, 且半衰期分别延长了1.0,0.9,2.3 h； M372I-T379S AK最适温度为30 ℃, 比WT AK高2 ℃； 当浓度为1~10 mmol/L时, 突变体均削弱或部分解除了抑制剂Lys的反馈抑制作用.     

玉米半胱氨酸蛋白酶的原核表达及酶学性质表征

以玉米基因组DNA为模板扩增获得玉米半胱氨酸蛋白酶基因(zmCP1),先将其克隆至pET-28a(+)原核表达载体中,再转化至大肠杆菌BL21(DE3)中.对重组酶进行诱导表达后经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白免疫印迹(Western blotting)鉴定,经Ni柱纯化后其质量分数大于95%.利用二肽荧光底物(R-AMC)和四肽荧光底物(LAFR-AMC)进行酶反应动力学实验,证明该酶对小底物R-AMC具有更好的亲和力和催化活性.重组酶的酶学性质研究表明,该酶最适温度为55℃,最适pH值为6.0,在90℃下的半衰期为39.82min.     

灵芝三萜提取工艺的优化

以灵芝孢子粉为原料,使用体积分数为70%的乙醇为提取剂,采用酶解与超声辅助提取相结合的方法,将不同液固比、超声时间、酶解时间和酶用量设定为4个因素,进行单因素试验并设计响应面试验,以确定最优提取方式及其影响因素.利用大孔树脂层析法对灵芝三萜进行分离纯化,通过优化分离纯化工艺,确定最佳洗脱树脂、洗脱液体积分数、上样液流速以及上样液质量比.采用高效液相色谱法分析灵芝总三萜的组分差异.通过预实验分析,与单一提取法相比,酶+超声辅助提取更高效.采用乙醇为提取剂提取灵芝中三萜类化合物可提高三萜的纯度.最优条件下可实现对三萜含量的快速、精确测定,为灵芝三萜的分离纯化提供理论依据.     

北京棒杆菌天冬氨酸激酶M372I-T379S双突变体的构建及其酶学性质

为构建高酶活力天冬氨酸激酶(aspartokinase, AK), 并削弱或解除Lys(lysine)反馈抑制作用突变体, 通过定点突变和高通量筛选技术构建突变体M372I,T379S和M372I-T379S, 对野生型（WT）和突变体分别进行诱导表达、 纯化及酶学性质表征. 结果表明： 突变体M372I,T379S和M372I-T379S AK与WTAK相比, V_max分别提高了13.77,15.02,15.60倍, K_m和n值均降低； 最适pH值分别升高为8.0,8.5,8.5, 且半衰期分别延长了1.0,0.9,2.3 h； M372I-T379S AK最适温度为30 ℃, 比WT AK高2 ℃； 当浓度为1~10 mmol/L时, 突变体均削弱或部分解除了抑制剂Lys的反馈抑制作用.     

嗜热菌Thermaerobacter subterraneus DSM13965磷酸三酯酶的原核表达、 ]纯化及性质表征

将来源于嗜热菌Thermaerobacter subterraneus DSM13965的磷酸三酯酶基因在大肠杆菌BL21中高效表达, 并采用超声、 热失活和组氨酸标签
镍柱对产物进行分离纯化, 通过SDS PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定. 结果表明: 该重组酶以二聚体的寡聚体形式存在; 其最适温度为70 ℃, 最适pH=10.0, 具有良好的热稳定性.     

嗜热菌Pyrococcus horikoshii OT3蛋白酶基因的原核表达、纯化和性质表征

将来源于嗜热菌Pyrococcus horikoshii OT3的蛋白酶(PH1704)基因在大肠杆菌BLP-CodonPlus中高效表达.采用超声、热失活和HiTrap Q Sepharose柱层析等方法对产物进行分离纯化.通过SDS-PAGE,Native-PAGE和Western-blot对表达产物进行鉴定,发现该重组酶以十二聚体为主的寡聚体形式存在,并具有SDS抗性.蛋白酶活力染色表明,其六聚体以上有活力.以azo-gelation为底物,对其酶学性质进行初步研究表明,其最适温度为85℃,最适pH=8.0,并且具有良好的热稳定性.