小鼠精子微注射受精卵的体外发育与移植的研究

用显微注射方法,将精子注入小鼠卵母细胞卵周隙中,使精卵体外受精获得受精卵。并对精子注射后卵母细胞的成活率、受精率和受精卵的发育率以及移植后受胎率等方面进行了系统的研究,结果表明:卵子存活率为75.36％(1309/1737),其中264枚卵裂,受精率为20·17％(264/1309),卵裂卵经体外培养后有192枚发育到桑椹胚及胚泡期,发育率为72.73％(192/264)。将其中73枚(桑椹胚10枚,肛泡63枚)胚胎移植到10只假孕受体子宫中,一只受体妊娠产仔9只,仔鼠发育正常。     

绵羊受精卵(早期胚胎)的移植

将56个良种羊(细毛羊及三北羔皮羊)的受精卵,移植到55只与供体发情同步(发情后1—4天)的蒙古羊及杂种母羊体内。除一只母羊接受2个2—4细胞的受精卵外,其它54只每只只接受一个2—16细胞的受精卵。在术后20天之内,用试情公羊试情,受体如不再返情可判断为已受胎。在55只受体中除一只因故死亡外,已受胎者41只,返情者13只,移植受胎率为76％。41只受体母羊中,除一只因病死亡(尸检子宫角内有一胎儿)外,其余40只中有37只按予产期先后产羔,共产羔38只(其中一只产双羔),经鉴定全部为移植卵所发育成者,另3只由于早期流产造成空怀。     

绵羊β—乳球蛋白基因5′端及上游调控序列的PCR扩增的方法学研究

本对绵羊β-乳球蛋白基因5′端及上游调控序列的PCR扩增的方法扩增进行了研究。经比较分析,将从羊血中提取的绵羊基因组DNA的模板用量定为4μl(0.4μg/μl）,TaqDNA聚合酶用量为0．83μl(3u/μl）,变性为94℃1min,退火为64℃1min72℃延伸2min,循环次数为32次,获得的PCR产物经电泳检测,条带明亮,特异性高,大小为898bp。经序列分析发现,与已知基因组序列一致性达99％以上,可用于指导外源基因在转基因动物乳腺中表达。     

冷冻保存小鼠胚胎简易方法的研究

小鼠胚胎在冷冻保护剂二甲亚砜(DMSO)存在下,冷冻到-196℃,解冻以后可以存活。在无胚胎冷冻机的条件下,我们用简易冷冻装置,将不同胚龄的鼠胚放入其中,经缓慢降温后保存于液氮内。冷冻胚胎快速解冻后,胚胎回收率达67—79%。选择解冻后正常胚胎进行体外培养,48—72小时后能进一步发育为其存活标准,冷冻后胚胎存活率为66.07%。此方法简便易行便于推广。     

哺乳动物早期胚胎活力的测定——活体及非活体染色法

家兔及小白鼠的早期胚胎(2细胞—桑椹胚),用中性红及台盼兰进行活体及非活体染色,可以将活胚及死胚区别开来。我们对225个小白鼠早期胚胎和239个兔早期胚胎进行染色,获得染成淡粉色鼠胚105个,兔胚201个,染成兰紫色的鼠胚37个兔胚14个。经过早期胚胎的体外培养及体内移植实验证明:染成淡粉色的胚胎为活胚,染成兰紫色为死胚。本实验共培养了46个着淡粉色兔胚,经过14小时培养以后,其最高发育率可达90％。将6个着淡粉色兔胚进行移植,第14天剖腹检查受体,其受胎率为100％。将6个染成兰紫色的兔胚在体外培养,经过24小时以后其发育率为O％。6个兰紫色胚经过移植,其受胎率为O％。     

微注射MT-hGH融合基因后,小鼠原核卵体外发育和移植的研究

用微注射方法,将MT-hGH融合基因注入昆明白小鼠原核卵的雄原核中,观察外源基因或其它成分(培养液,TE缓冲液),注入原核后对原核卵的存活率,卵裂率和体外培养条件下胚胎发育的影响。原核卵在雄原核内注入2pl MT-hGH基因悬液后存活率为86.17％,与只穿刺雄原核但不注射,注射培养液或TE缓冲液后存活率相近(分别为84.94％,84.49％和86.42％)。原核卵在注射MT-hGH基因后体外培养24h,活胚卵裂率显著降低(对照组为93.98％,注射组为87.96％P<0.01),注射MT-hGH基因组在体外培养下,2细胞胚到胚泡期的发育率明显低于对照组(分别为40.66％和64.09％,P<0.05)。注射组胚胎发育速度延缓。     

微注射MT-hGH融合基因后小鼠原核卵体外发育和移植的研究

将MT-hGH(小鼠金属巯因启动子--人生长激素基因)融合基因,用微注射的方法注入昆明白小鼠原核卵的雄原核中,观察注射外源基因对原核卵的存活,卵裂及2细胞胚胎体外发育的影响。实验结果表明,昆明白小鼠原核卵在雄原核内注射2p1 MT-hGH基因悬液后存活率为86.71％,其存活率与只穿刺雄原核不注射:注射培养液;注射TE缓衡液后存活率相近(分别为84.94％,84.4％和86.42％)。基因注射后原核卵存活率降低主要由注射针机械刺激引起的。原核卵在注射MT-hGH基因后注射胚卵裂率显著降低,以培养24h统计。注射培养液组活胚卵裂率为93.98％,丽注射基因组仅为87.96％(P<0.01)。注射MT-hGH基因组在体外培养条件下,2细胞到胚泡的发育率为40.66％,而注射培养液的对照组为64.09％(P<0.05)。注射基因组胚胎发育速度延缓,部分胚胎延缓12h。将基因注射后的原核卵经体外培养形成的198枚2细胞胚。45枚桑椹胚和161枚胚泡,移植给54只假孕受体,其中16只受体妊娠,产仔49只。目前存活25只。85日龄时。有6只小鼠体重为对照组平均体重的1.207～1.353倍,生长速度较快。经检测其中有5只呈阳性反应为转基因小鼠。