中国红系冀南黄牛的克隆及其繁殖性能

以濒临灭绝的中国红系冀南黄牛的颗粒细胞为核供体进行了体细胞克隆研究. 共操作卵母细胞211枚, 去核166枚(79%), 构建重构胚112枚(67.4%), 其中分裂的重构胚为94枚(83%), 第7天发育成囊胚数为48枚(43%). 共移植荷斯坦奶牛受体6头, 妊娠2头(33%), 其中1头流产, 另1头产出一头健康牛犊. 比较了不同融合液(甘露醇和Zimmerman融合液)对克隆胚胎融合率和囊胚发育率的影响以及不同激活方法(钙离子载体(A23187)+6-DMAP和放线菌酮+CB)对克隆胚胎囊胚发育率的影响. 结果表明: (ⅰ) 在电场强度为2.5 kV/cm, 脉冲时间为10 ms, 脉冲次数为2的条件下, 克隆胚胎在甘露醇融合液中的电融合率比在Zimmerman融合液中的电融合率高(71% vs 61%, P＜0.05), 且囊胚发育率差异不显著(36% vs 39%, P＞0.05 ); (ⅱ) 以钙离子载体(A23187)+6-DMAP激活组与放线菌酮+CB激活组处理的克隆胚胎囊胚发育率无明显差别(42% vs 46%, P＞0.05). 依据牛的28个微卫星位点对供体牛、克隆牛和代孕母牛进行微卫星分析, 结果表明, 克隆牛与供体牛的遗传物质完全相同, 而与代孕母牛在遗传上无任何相关. 目前, 该克隆冀南黄牛已经产犊, 克隆冀南黄牛的各项繁殖性能指标均与正常冀南牛犊相符, 所产牛犊的生长发育正常.     

瘦素对猪卵母细胞体外成熟及克隆猪妊娠率的影响

体细胞克隆猪在人类医学、基础科学研究和畜牧业生产方面均具有很大的应用潜力.为了提高体细胞克隆猪的效率,首先比较了两种基础成熟液NCSU-23和TCM199的体外成熟效果,然后在TCM199培养液的基础上,较系统地研究了添加不同浓度的瘦素对猪卵母细胞成熟、孤雌激活胚胎和克隆胚胎的体外发育以及克隆胚胎体内发育的影响.结果表明:成熟液中添加100ng/mL或200ng/mL瘦素对猪卵母细胞的核成熟没有显著影响(P>0.05);对孤雌激活卵裂率和克隆胚胎卵裂率也没有显著影响(P>0.05);但却显著提高了孤雌激活胚胎的囊胚率和囊胚细胞数,并且显著提高了克隆胚胎的囊胚率;当添加量为100ng/mL时,克隆囊胚的细胞数显著升高.另外,研究表明,瘦素很可能具有提高克隆胚胎移植妊娠率和妊娠到期率的作用.     

体细胞核移植牛肺脏中H19和Xist基因的DNA甲基化状态

在体细胞核移植中, 体细胞的供体核要经过表观遗传修饰的重编程才能获得发育的全能性, 目前认为不完全的表观重编程是导致克隆效率低的主要原因. DNA甲基化是基因组主要的表观遗传修饰方式, 是调节基因组功能的重要手段. 为了探求核移植过程中DNA甲基化的表观重编程是否充分, 利用亚硫酸氢盐测序法分析了印记基因H19和Xist在出生48 h内死亡的体细胞核移植牛和正常对照牛肺脏中的DNA甲基化状态. 结果发现, 体细胞核移植牛中H19基因甲基化程度较低, 与正常对照组相比差异显著(P < 0.05), 并且 9C3个体有3个CpG (第1, 2, 3位)表现出完全非甲基化; Xist基因甲基化程度在体细胞核移植牛和正常对照牛中都较高, 且没有显著差异.     

低氧培养早期胚胎克隆小型猪(Sus Scrofa)

猪的体细胞克隆在人类的异种器官移植方面有着巨大的应用前景. 以中国实验用小型猪胎儿成纤维细胞为核供体, 从屠宰场采集初情期前母猪的卵巢, 卵母细胞体外成熟后去核构建克隆胚胎, 重构卵电融合并激活, 在7% O₂, 5% CO₂及88% N₂的气相条件下NCSU-23或PZM-3培养基培养. 给3头代孕母猪移植230枚克隆胚胎, 其中一头妊娠足月并产下3头仔猪, 生产克隆猪的效率达到1.3%; 其中一头健康状况良好, 存活至今, 毛色及DNA微卫星遗传分析证实为克隆个体. 以上结果表明, 利用初情期前母猪的卵母细胞, 克隆胚胎培养在低氧条件下, 是生产克隆猪的一条有效途径.     

利用体细胞核移植技术生产表达增强绿色荧光蛋白（EGFP）的转人溶菌酶基因（HLY）的 猪克隆胚胎

由于生理特性和器官大小的原因,猪在人类疾病模型和器官移植方面具有很大的应用潜力.正因如此,猪基因结构的修饰对农业生产和人类医学两方面都意义重大.研究用脂质体介导的方法转染了猪胎儿成纤维细胞,所用结构为双标的人溶菌酶质粒(pBC1-HLY-GFP-NEO).分别对包含两个品种（五指山猪、长白猪）的5个细胞系（sw7,sw8,slw3,slw6和slw9）进行了转染.经过14d,1000μg/mL浓度G418药物的筛选处理,sw7,sw8,slw3和slw6等4个细胞系的95%以上细胞都表达绿色荧光蛋白,而细胞系slw9的转染效率只有49.3%.用转染效率高的3个细胞系作为核供体构建猪克隆胚胎,通过电刺激方法进行融合和激活,然后在PZM3中体外培养.48h后,重构胚的平均卵裂率为76.7%;经过7d培养后观察,有18.5%的胚胎发育到囊胚阶段,其中93.3%的囊胚在荧光显微镜下能够发出绿色荧光,但囊胚之间的荧光强度存在差异.研究结果表明,通过脂质体介导的方法可以获得高转染效率的转基因猪胎儿成纤维细胞系,但细胞系之间的转染效率不同;用转基因猪胎儿成纤维细胞构建的重构胚,能够成功发育到囊胚阶段,而且大多数为表达绿色荧光蛋白的阳性胚胎.     

双标记选择载体转染牛胎儿成纤维细胞方法的建立

以经SspI和BamHI对所构建的双标记选择载体质粒pCE-EGFP-IRES-Neo-dNdB双酶切后的线性目的DNA为外源基因,对电击介导的牛胎儿成纤维细胞基因转染方法的效率进行了优化.实验结果表明,当电场强度为1.2kV/cm、脉冲时间为1ms时可获得约50个阳性细胞克隆/10 5 个细胞的最佳转染效率.通过牛胎儿成纤维细胞对不同浓度G418抗性的敏感性实验确定800μg/mL G418为快速筛选浓度,以300μg/mL G418为维持筛选浓度.从两个牛胎儿成纤维细胞系中共分离了56个绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞克隆,从中选取2个冷冻保存.经PCR检测,证实2个冷冻克隆株均含有所转染的外源基因.     

染色质修饰基因在新生死亡克隆牛组织中的表达分析

体细胞克隆的效率非常低, 只有低于4%的重组胚胎可以发育成个体, 而且许多的克隆动物在出生后不久死亡并表现出组织器官的发育异常. 为了探讨造成克隆动物出生死亡以及器官发育异常的可能分子机理, 用荧光定量RT-PCR技术分析了4个对染色质进行修饰的基因(DNMT1, PCAF, MeCP2, EED)在分别来自两种供体细胞(成年成纤维细胞和胎儿成纤维细胞)的出生死亡克隆牛的6个组织(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和大脑)的表达. 结果发现, DNMT1在两种供体细胞的克隆牛心脏(P < 0.05)、肝脏(P < 0.05)和大脑(P < 0.01)中的表达显著高于正常对照牛; PCAF则在心脏(P < 0.01)和肝脏(P < 0.05)中的表达显著高于正常对照牛, 而在成年成纤维供体细胞克隆牛的脾脏(P < 0.05)中显著降低; MeCP2和EED基因在体细胞克隆牛中的表达与正常对照牛中无显著差异. 由于DNMT1和PCAF基因在DNA的甲基化以及组蛋白的乙酰化中起重要作用, 其正常表达为供体核后成修饰的精确重编程所必须, 所以DNMT1和PCAF的异常表达可能是造成克隆动物出生死亡以及器官发育异常的原因之一.     

转基因小鼠乳腺表达重组人溶菌酶

人溶菌酶是由130个氨基酸组成的碱性多肽, 具有抗菌、抗病毒和增强免疫力的功能, 对生物体的自身防御起着重要作用. 为研究乳腺生物反应器表达重组人溶菌酶和提高牛奶的免疫活性, 制备了以溶菌酶基因组序列为目标基因的表达载体的转基因小鼠模型. 经转基因小鼠的制备, 通过PCR和Southern blot 检测, 从83只出生小鼠中获得6只整合人溶菌酶融合基因的转基因小鼠. 对F1代小鼠的PCR检测表明外源基因可以遗传给后代. 在3只转基因阳性母鼠的乳汁中, 用Western blot方法可以检测到重组人溶菌酶的存在, 最高表达量达到0.2 mg/mL. 经活性检测, 转基因小鼠乳清的溶菌酶活性显著提高, 已达到人乳清溶菌酶活性的0.4倍, 而非转基因小鼠乳清具有极低的溶菌酶活性. 尽管转基因小鼠乳清中重组人溶菌酶活性还低于人乳清中溶菌酶活性, 但是转基因小鼠乳汁中的重组人溶菌酶与人溶菌酶具有相同的比活力. 为乳腺生物反应器表达重组人溶菌酶的研究和开发应用打下了坚实的基础.     

利用体细胞核移植技术生产转基因牛

通过电穿孔的方法, 将含有新霉素抗性(Neo^r)基因和增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的双标记选择载体导入胎牛输卵管上皮细胞, 获得了转基因细胞株. 以转基因细胞为核供体, 进行了牛的体细胞核移植. 重构胚胎424枚, 其中208枚体外发育至囊胚, 囊胚发育率为49.1%. 选择第7天转基因囊胚17枚移入17头同期发情的受体牛子宫角内, 共有5头受体牛妊娠, 妊娠率为29.4%. 经过正常的体内发育, 有3头转基因克隆牛出生, 产犊率为17.6%. PCR和Southern检测结果表明, 3头转基因克隆牛的基因组中都整合有外源目标基因. 并且, 绿色荧光蛋白在转基因克隆牛的耳部皮肤组织以及从耳部皮肤组织分离出的成纤维细胞中均有表达. 上述结果显示, 通过体细胞核移植技术可以有效生产转基因牛; 所构建的双标记选择载体可以有效筛选出转基因细胞和转基因克隆胚胎, 应用于转基因克隆动物的生产, 确保所培育的克隆动物均为转基因动物.     

季节对猪体外成熟卵母细胞的发育能力的影响

猪的卵母细胞对外界环境非常敏感,这造成猪的胚胎学相关研究是家畜繁殖学研究领域中最困难的方面之一.文章的研究目的是描述季节的变化对体外成熟卵母细胞发育能力的影响.研究中比较了不同季节每对卵巢获得A/B级卵的数量以及卵母细胞核成熟的比例(实验1),另外统计分析了不同季节孤雌(实验2)和核移植(实验3)胚胎发育能力的差异,最后在冬春两季分别进行了克隆胚胎的移植以观测其体内发育情况(实验4).结果显示实验1,春季(3月到5月)COCs/卵巢的比例最高(7.6±3.5),夏,秋,冬季的比例依次是(6.4±3.3),(6.7±2.9),(6.7±3.4),p<0.05.然而,没有发现卵母细胞的MⅡ比例有显著性差异((75.3±3.3)%,(73.5±2.3)%,(73.0±4.2)%,(76.5±6.7)%,依次是春,夏,秋,冬季的MⅡ比例,p<0.05).实验2,观察到夏季孤雌胚胎的囊胚率显著性降低(10.1±2.6)%,春,秋,冬季的孤雌胚胎囊胚率依次是(27.2±3.4)%,(22.4±3.5)%,(22.4±3.4)%,p<0.05.实验3,猪体细胞克隆胚胎在春季囊胚率获得提高((12.2±1.3)%,秋,冬季的克隆胚胎囊胚率依次是(10.2±1.2)%,(8.1±1.4)%,p<0.05).实验4,发现冬季胚胎移植无论是妊娠率还是出生率都明显低于春季.以上结果表明季节变化影响体外成熟卵母细胞的发育能力.