乙酰胆碱酯酶壳聚糖膜的制备研究

以新鲜母鸡血为材料,30%～70%(V/V)乙醇分步沉淀制备粗酶制剂,再经DEAE-Cellulose与Sephadex G-75 柱层析,部分纯化鸡红细胞乙酰胆碱酯酶(AChE),再以壳聚糖制备成膜作为载体,采用吸附-交联法固定AChE制备壳聚糖酶膜,分别考察制备壳聚糖酶膜的壳聚糖浓度(0、0.05、0.1、0.15、0.2g/ml),壳聚糖酶膜的吸附时间(2、4、6、8、10、12h)和吸附温度(0、4、25、30、37℃),以及戊二醛质量浓度(0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%),戊二醛交联时间(40、80、120、160、1200min),戊二醛交联温度(0、4、25、37℃)和给酶量(0～2000U/ml)对壳聚糖酶膜固定化效果的影响.结果显示,鸡红细胞AChE粗酶制剂的部分纯化倍数为12倍时,活力回收34.1%.优化的固定化条件是以0.1g/ml壳聚糖溶液制备载体膜,采用950 U/ml的酶液(蛋白质含量为 0.43 mg/ml),在4℃下吸附10 h,再以质量浓度为0.6%的戊二醛溶液4℃下交联2h.此条件下制备的酶膜活力达11.5 U/cm2,活力回收达 30%.     

乙酰胆碱酯酶膜的酶学性质及其对有机磷农药的检测效果

测定自行制备的乙酰胆碱酯酶(AChE)酶液和壳聚糖-AChE酶膜的酶学性质,并以壳聚糖-AChE酶膜分别检测乐果、甲胺磷、敌百虫、敌敌畏、甲基对硫磷5种有机磷农药,探讨采取酶膜进行快速检测有机磷农药残留的可行性.结果显示:壳聚糖-AChE酶膜的KappM为2.8×10-4mol/L,最适pH值为8.0,在pH值为8.0～8.5时活力稳定;最适反应温度为45℃左右,在15～60℃时较为稳定;半衰期达12d,固定化酶膜的实际应用性能较游离酶有较大改善.壳聚糖-AChE酶膜对不同类型的有机磷农药的敏感性差异很大,对甲基对硫磷最为敏感,其pI50为5.57,对其它4种农药pI50为4.0左右;以酶活力抑制率16%为农药检出标准,甲基对硫磷的检出限为0.4mmg/L,其他4种检出限为3～22mg/L,只有甲基对硫磷达到检测要求.