类弹性蛋白多肽-红色荧光蛋白融合蛋白的表达纯化及细胞相容性

目的 构建携带红色荧光蛋白(mCherry)标签的类弹性蛋白(ELP)原核表达载体,并表达纯化ELP-mCherry融合蛋白,探讨ELP-mCherry融合蛋白与细胞的相容性.方法 对利用限制性内切酶Xba I和Xho I对mCherry质粒和pET28a-ELP载体同时进行双酶切,将酶切产物回收、连接并转化DH5α大...     

SIRPα工程化外泌体阻断CD47/SIRPα信号轴研究

目的 制备分离表达SIRPα受体的外泌体,探讨SIRPα外泌体的结构特性、细胞相容性、细胞内分布及对CD47/SIRPα信号轴的阻断作用.方法 通过差异超速离心法从稳定表达SIRPα的HEK293T细胞中分离外泌体;通过动态光散射法(DLS)和透射电子显微镜(TEM)技术分析外泌体的尺寸和形貌特征;Western blotting检测外泌体中SIRPα-GFP融合蛋白的表达;通过MTT法检测外泌体与NIH3T3细胞的相容性;应用荧光成像技术研究外泌体的肿瘤细胞内吞;通过肿瘤细胞与巨噬细胞共孵育实验研究外泌体阻断CD47/SIRPα信号轴带来的肿瘤吞噬效果.结果 利用差异超速离心法分离得到尺寸约80 nm的SIRPα外泌体,透射电子显微镜下呈现为尺寸均一的圆球形结构;免疫印迹证实了外泌体上SIRPα的表达;MTT法结果显示SIRPα外泌体具有良好的生物相容性;荧光成像结果显示SIRPα外泌体被B16F10细胞内吞后分散在细胞质中;共孵育实验表明SIRPα外泌体与CD47单抗均能促进骨髓来源巨噬细胞吞噬黑色素瘤细胞.结论 成功分离了表面表达SIRPα受体的外泌体;SIRPα外泌体具有良好的细胞相容性;SIRPα外泌体可以成功阻断CD47/SIRPα信号通路,激活了巨噬细胞对肿瘤的吞噬功能.     

基于小热休克蛋白-细胞穿膜肽蛋白纳米粒的siRNA递送系统

利用大肠杆菌表达系统原核表达并纯化小热休克蛋白-细胞穿膜肽融合蛋白(Hsp-Tat);用动态光散射和透射电镜成像分析Hsp-Tat纳米粒的粒径和形貌;用噻唑蓝(MTT)法和活/死细胞染色法研究蛋白纳米粒的细胞相容性;用凝胶阻滞实验检测纳米粒的小干扰RNA(siRNA)复合特性;用激光共聚焦荧光显微镜成像研究蛋白纳米粒的...     

融合聚精氨酸九肽的小热休克蛋白 原核表达及蛋白纯化

目的构建小热休克蛋白-聚精氨酸九肽融合蛋白的原核表达载体,表达纯化融合蛋白.方法在小热休克蛋白表达载体的基础上利用点突变方法引入聚精氨酸九肽对应序列,转入BL21大肠杆菌感受态细胞进行原核表达,利用亲和层析方法对表达蛋白进行纯化.结果成功构建了融合聚精氨酸九肽的HSP16. 5融合蛋白表达载体,并对其在大肠杆菌细胞中的原核表达进行条件优化,研究显示:在诱导剂IPTG浓度为0. 5 mmol、37℃条件下诱导4 h目的蛋白产量较高.结论此实验成功构建了小热休克蛋白-聚精氨酸九肽融合蛋白的原核表达载体,得到了高纯度的小热休克蛋白-聚精氨酸九肽融合蛋白,为进一步研究其功能奠定基础.