SARS-CoV灭活疫苗制备及小鼠免疫研究

用Vero细胞大量增殖SARS-CoV病毒, 使用β-丙内酯作为灭活剂灭活病毒后, 用Sepharose 4 FF层析柱纯化病毒颗粒得到灭活疫苗, 并经Western-blot, 质谱, ELISA和电子显微镜检测证实. 用纯化的灭活疫苗加入或不加入氢氧化铝佐剂, 以不同的剂量免疫小鼠, 能够诱导小鼠产生抗体, 加入氢氧化铝佐剂组所产生的抗体高于不加入佐剂组.     

中国登革2型病毒反向遗传系统的构建与鉴定

为构建登革2型病毒中国分离株(DEN2-43)的反向遗传系统, 根据已测定的DEN2-43全基因组序列, 利用长链RT-PCR及融合PCR扩增此病毒基因组全长cDNA分子, 并将其克隆至低拷贝载体pWSK29中构建该病毒株的全长cDNA克隆. 将此克隆体外转录后, 经电穿孔导入宿主细胞获得恢复病毒. 结果表明, 获得的基因组全长cDNA克隆具有感染性, 所获得的恢复病毒具有与原型病毒类似的生物学性质及乳鼠神经毒力, 且可稳定传代. 该反向遗传系统的构建为深入探讨登革病毒的致病机理及新型疫苗的研制奠定了基础.     

衣壳蛋白缺失突变对登革病毒致病性及免疫原性的影响

在登革2型病毒中国分离株(DEN2—43)的感染性全长cDNA克隆的基础之上,利用融合PCR技术构建衣壳蛋白基因缺失的全长cDNA．将其线性化并体外转录成RNA后,经电穿孔法导入宿主细胞获得缺失突变病毒,对其致病性和免疫原性进行了观察．结果显示,随着衣壳蛋白缺失氨基酸残基数目的增加,病毒在敏感细胞中的增殖能力逐渐减弱,而衣壳蛋白第3个α螺旋序列缺失的突变体则完全丧失感染性．突变病毒对乳鼠的致病性也随之减弱,缺失10个氨基酸残基使病毒几乎完全丧失乳鼠致病力．同时缺失突变病毒可诱导小鼠产生高水平IgG抗体．表明登革病毒衣壳蛋白具有功能灵活性,可作为减毒突变的靶位点．该结果为深入探讨登革病毒基因组结构与功能的关系及研制新型登革减毒疫苗奠定了基础．     

SARS灭活疫苗对猴体的免疫原性及保护效果观察

观察SARS灭活疫苗对猴体的免疫原性及保护效果,为进一步的临床研究奠定基础.将BJ01株SARS病毒感染的Vero细胞的培养液过滤澄清,经β-丙内酯灭活和超滤浓缩,然后经凝胶过滤和离子交换层析获得纯化的SARS灭活疫苗.经HPLC分析其纯度为97.6%,在电子显微镜下可观察到SARS病毒样颗粒.蛋白质印迹(westernblotting)分析表明,纯化SARS灭活疫苗可与SARS患者恢复期血清起反应.纯化的SARS灭活疫苗符合有关的质量标准.用SARS灭活疫苗免疫猴体可产生高效价的中和抗体,可阻止SARS病毒在猴体内增殖,且对SARS病毒攻击具有保护作用.在低中和抗体情况下,用SARS病毒攻击免疫猴后没有出现感染增强现象.猴体免疫SARS灭活疫苗后,无论正常剂量还是大剂量疫苗免疫,均未发现局部和全身副反应,表明SARS灭活疫苗对猴体是安全的.     

SARS相关病毒(BJ01株)的全序列及其比较分析

严重急性呼吸综合征(SARS)是一种新发现的急性传染病. 对一株已确认为SARS病原体的冠状病毒(BJ01)进行了全基因组序列测定, 并与其他已知病毒进行了比较分析. 该病毒基因组全长为29.725 kb, 含11个可读框(ORFs), 由1个稳定区和1个可变区组成, 其中稳定区编码RNA依赖性RNA聚合酶, 包括两个ORFs；可变区含有4个蛋白质编码序列(CDSs), 分别编码病毒的4个结构蛋白(S, E, M, N蛋白). 此外, 可变区还包括5个非典型的预测蛋白(PUPs). 此病毒基因的排列顺序与其他已知的冠状病毒一致. 通过与已知RNA病毒的序列比对, 可以确认该病毒属于冠状病毒科(Coronaviridae). 与GenBank中已知的5个SARS相关病毒全基因组序列的比较分析显示, 已在30个核苷酸位置上检出序列差异, 总体突变率为0.1%, 其中15个变异位点在编码区, 可能会导致蛋白质的氨基酸改变(异义突变). S蛋白中已发现3处可能引起该蛋白质物化特征变化的变异, 而该蛋白质可能参与病毒与宿主间的免疫反应. 与病毒包膜形成相关的M蛋白中则已发现两处氨基酸变化. 进化分析表明, SARS病毒可能不是来源于人类, 但没有证据证明是人为制造的. 为了阐明SARS相关病毒的病因学以及排除其他可能的SARS病原体的存在, 仍需进行更深入的研究.