绵羊β—乳球蛋白基因5′端及上游调控序列的PCR扩增的方法学研究

本对绵羊β-乳球蛋白基因5′端及上游调控序列的PCR扩增的方法扩增进行了研究。经比较分析,将从羊血中提取的绵羊基因组DNA的模板用量定为4μl(0.4μg/μl）,TaqDNA聚合酶用量为0．83μl(3u/μl）,变性为94℃1min,退火为64℃1min72℃延伸2min,循环次数为32次,获得的PCR产物经电泳检测,条带明亮,特异性高,大小为898bp。经序列分析发现,与已知基因组序列一致性达99％以上,可用于指导外源基因在转基因动物乳腺中表达。     

外源基因在转基因动物乳腺中的特异性表达研究

动物基因工程研究最大的突破就是转基因动物研究的进展,自八十年代初第一批转基因小鼠问世以来,转基因动物的研究已从方法学研究步入了应用性研究阶段,转基因动物除作为研究工具广泛应用于发育生物学、免疫学、遗传学以及医学等生命科学领域外,外源基因在转基因动物的特异性表达,尤其是在乳腺的表达,又可将转基因用作生物反应器进行了生物活性蛋白的生产而于商业生产,在转基因动物乳腺的特异性表达研究中,寻找乳蛋白基因调控     

绵羊β—乳球蛋白基因调空序的分离,克隆及序列分析

根据绵羊β－乳球蛋白基因调控区ＤＮＡ序列设计了两个引物，以绵羊基因组ＤＮＡ为模板，用ＰＣＲ技术扩增，得约９００ｂｐ的ＤＮＡ片段插入到ｐＵＣ１８质粒的ＸｂａＩ／ＫｐｎＩ位点之间。     

微注射MT-hGH融合基因后,小鼠原核卵体外发育和移植的研究

用微注射方法,将MT-hGH融合基因注入昆明白小鼠原核卵的雄原核中,观察外源基因或其它成分(培养液,TE缓冲液),注入原核后对原核卵的存活率,卵裂率和体外培养条件下胚胎发育的影响。原核卵在雄原核内注入2pl MT-hGH基因悬液后存活率为86.17％,与只穿刺雄原核但不注射,注射培养液或TE缓冲液后存活率相近(分别为84.94％,84.49％和86.42％)。原核卵在注射MT-hGH基因后体外培养24h,活胚卵裂率显著降低(对照组为93.98％,注射组为87.96％P<0.01),注射MT-hGH基因组在体外培养下,2细胞胚到胚泡期的发育率明显低于对照组(分别为40.66％和64.09％,P<0.05)。注射组胚胎发育速度延缓。     

产生乳腺定位表达人CD14的转基因小鼠研究

将来自ＰＣＲ法合成的绵羊β－乳球蛋白基因（ＢＬＧ）５’端８９８ｂｐ上游区和人单核细胞表面分化抗原基因（ｈＣＤ１４）成熟肽１２４５ｂｐ片段构建的ＢＬＧ－ｈＣＤ１４融合基因纯化后,注入小鼠受精卵原核。实验共注射受精卵１１４９枚,经体外培养发育到２－细胞期的胚胎计９６８枚,发育率为８４．２％。从发育的胚胎中选择６３４枚移植到４６只假孕受体。其中１４只妊娠产仔,妊娠率３０．４％。妊娠受体共移植胚移２０７枚     

人骨髓单核细胞表面分化抗原CD14基因的扩增、克隆和鉴定

根据人骨髓单核细胞表面分化抗原ＣＤ１４（ｈＣＤ１４）基因的核苷酸序列，设计ｈＣＤ１４基因５＇端和３＇端的两个引物．以人血中提取的基因组总ＤＮＡ为模板，利用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）技术特异性扩增该基因１２４５加的编码序列．扩增产物经Ｘｂａｌ、ＫｐｎⅠ双酶切后，克隆到ｐＵＣ１８质粒ＸｂａＩ－ＫｐｎＩ位点间，随后转化大肠杆菌ＪＭ１０９．用ＰＣＲ方法筛选出重组菌落．经酶切和序列分析方法检测后，证明获得了含ｈＣＤ１４基因的重组克隆ｐＨＣＤ１４．巳测出的插入片段５＇端部分中包含着人ＣＤ１４基因４８８ｂｐ的序列，与巳报道的相应ＤＮＡ序列相比具有９９％的同源性．     

人骨髓单核细胞表面分化抗原CD14基因的扩增,克隆和…

根据人骨髓单核细胞表面分化抗原ＣＤ１４基因的核苷酸序列，设计ｈＣＤ１４基因５＇端和和３＇端的两个引物。以人血中提取的基因组总ＤＮＡ为模板，利用聚合酶链式反应技术特异性扩增该基因１４５ｂｐ的编码序列。     

胚胎分割、分割胚的体外培养及移植

用玻璃微针对小鼠胚胎进行分割,分割的裸半胚经体外培养和移植到受体后,获得由半胚发育的仔鼠。小鼠早期胚胎(2细胞,8细胞阶段)在链霉蛋白酶中软化透明带后,用直径为0.5μm的玻微针徒手对胚胎进行切割。切割的半胚体外培养24～48h,观察半胚的活力、发育率、发育阶段及胚泡的大小与未切割的正常胚胎进行比较。共切割胚胎342枚,切割后成活的半胚为411枚,半胚成活率为60.08％(411/682)。2细胞和8细胞阶段切割的半胚,成活率分别为     

微注射MT-hGH融合基因后小鼠原核卵体外发育和移植的研究

将MT-hGH(小鼠金属巯因启动子--人生长激素基因)融合基因,用微注射的方法注入昆明白小鼠原核卵的雄原核中,观察注射外源基因对原核卵的存活,卵裂及2细胞胚胎体外发育的影响。实验结果表明,昆明白小鼠原核卵在雄原核内注射2p1 MT-hGH基因悬液后存活率为86.71％,其存活率与只穿刺雄原核不注射:注射培养液;注射TE缓衡液后存活率相近(分别为84.94％,84.4％和86.42％)。基因注射后原核卵存活率降低主要由注射针机械刺激引起的。原核卵在注射MT-hGH基因后注射胚卵裂率显著降低,以培养24h统计。注射培养液组活胚卵裂率为93.98％,丽注射基因组仅为87.96％(P<0.01)。注射MT-hGH基因组在体外培养条件下,2细胞到胚泡的发育率为40.66％,而注射培养液的对照组为64.09％(P<0.05)。注射基因组胚胎发育速度延缓,部分胚胎延缓12h。将基因注射后的原核卵经体外培养形成的198枚2细胞胚。45枚桑椹胚和161枚胚泡,移植给54只假孕受体,其中16只受体妊娠,产仔49只。目前存活25只。85日龄时。有6只小鼠体重为对照组平均体重的1.207～1.353倍,生长速度较快。经检测其中有5只呈阳性反应为转基因小鼠。