高效切割Hipp11 敲入位点的sgRNA 设计及活性验证

摘要: 目的设计并验证能够高效切割Hipp11 位点的sgRNA,为在Hipp11 位点定点敲入外源基因提供工作基础。方法使用预测软件对Hipp11 位点的sgRNA 进行预测并挑选脱靶效应较低的两个sgRNA。构建相应载体,通过CRISPR/Cas9 活性检测试剂盒在体外检测sgRNA 的活性。选取活性较高的sgRNA 体外转录,与Cas9 mRNA 一并注射受精卵。检测出生后小鼠Hipp11 位点切割效率,计算出sgRNA 的体内活性。结果两个sgRNA 的体外活性分别为19. 2%和51. 7%,使用体外活性高的2 号sgRNA 显微注射获得8 只新生小鼠,其中62. 5% ( 5 /8) 的小鼠中检测到Hipp11 位点周围发生碱基插入或缺失。结论获得一个能够引导高效切割的Hipp11 位点通用型sgRNA,从而为基因CRISPR 技术在Hipp11 位点定点插入外源基因奠定基础。sgRNA 体外活性能够预测sgRNA 在体内的切割活性,表明体外活性验证是筛选高活性sgRNA 的有效手段。