交叉酶切联合MALDI-TOF/MS分析重组蛋白二硫键分布的方法建立

 以Kringle环为分子模型,应用MALDI-TOF/MS联合特异性蛋白酶酶切技术,探讨建立蛋白质二硫键分布和定位分析的研究方法。采用pET22b(+)原核表达体系诱导表达重组人纤溶酶原K5蛋白（rhK5）,经Ni²⁺-NTA resin亲和层析纯化,并通过SDS PAGE和Western blot进行初步鉴定;采用MTT法分析rhK5对微血管内皮细胞的抑制活性;联合应用交叉酶切（Trypsin Gold单切或Trypsin Gold及Endoproteinase ASP N双酶切）和基质辅助激光解析-飞行时间质谱（MALDI TOF/MS）分析rhK5的二硫键分布;并应用生物信息学方法和圆二色谱法进一步验证rhK5二级结构。应用原核体系高效表达具有生物活性的rhK5蛋白,经交叉酶切联合MALDI-TOF/MS证实rhK5中的6个半胱氨酸正确配对形成了3对二硫键（Cys462:541, Cys483:524和Cys512:536）,圆二色谱法测定发现rhK5为典型的β折叠型结构。上述研究结果为分析基因工程重组蛋白质中半胱氨酸配对及二硫键分布提供了方法学基础。