新型rPA(K)原核表达载体的构建及初步表达

利用PCR技术,获得了rPA(K)cDNA片段,将其克隆至pET-30a( ),成功构建了新型的rPA(K)原核载体pLrA(K),并实现了其在大肠杆菌中的初步表达,经IPTG(终浓度为1 mmol/L)分别于37℃诱导1,2,3 h后,以Bio-Rad凝胶成像仪分析目的蛋白,相对含量分别是19%,15.8%和24.3%,平均密度分别是0.13,0.14和0.16,IPTG诱导3 h后蛋白表达量最高.ELISA结果显示表达产物与抗t-PA抗体呈现特异性阳性反应,进一步参考标准曲线得出样品中rPA(K)的平均含量为210 μg/L.     

rPA(K)的定点突变及其真核表达载体在COS-7细胞中的瞬时表达

采用定点突变技术,对真核表达载体pCSRK上的目的片段rPA(K)进行突变,获得了含有突变体rPA(KN)(N184→Q)的真核表达载体pCSRKN.酶切和测序结果证明,成功去除了184位的糖基化位点.用LipofectamineTM2000 Reagent将pCSRKN转染至COS-7细胞,取转染后不同培养时间上清,以FAPA法进行检测.结果表明,表达产物具有良好的溶圈活性,从而验证了pCSRKN在真核系统表达的可行性.