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通过重叠聚合酶链式反应,将黑曲霉植酸酶(Aspergillus niger NRRL 3135phytase)第238~337位与第382~444位多肽片段的基因编码序列替换为烟曲霉植酸酶(Aspergillus fumigatus ATCC 13073phytase)中的对应序列,构建片段置换植酸酶(Fragments-replaced phytase)基因.将插入该基因的pGAPZαA重组质粒转化入毕赤酵母.通过离子交换与凝胶过滤纯化,获得重组酵母分泌的活性片段置换植酸酶.与黑曲霉植酸酶相比,片段置换显著提高了片段置换植酸酶的胰蛋白酶耐受性.而通过脱糖基化酶PNGase彻底去除N-糖基化,可恢复片段置换植酸酶对胰蛋白酶的敏感性.上述结果表明烟曲霉植酸酶对应片段上的N-糖基化修饰可显著提高毕赤酵母表达的黑曲霉植酸酶的胰蛋白酶耐受性. 相似文献
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为系统评估重组毕赤酵母植酸酶的N-糖基化充分性,建立了一种通过联用高效液相色谱-串级质谱来分析植酸酶氨基酸序列及N-糖基化位点的技术.分别发酵了3株基因组已整合不同植酸酶基因的毕赤酵母.发酵液上清经离子交换与凝胶过滤后获得纯化的植酸酶.使用PNGase F或Endo H脱糖基化酶处理植酸酶后,用胰蛋白酶消化脱糖基化产物.通过纳升级高效液相色谱分离胰蛋白酶切产生的肽段混合物.并在联用的串级质谱上进行肽段测序与N-糖基化位点鉴定.结果显示3种植酸酶蛋白的可检测序列覆盖率均在69%以上,且与文献报道不同,均存在糖基化位点修饰不充分的现象.本实验结果证明了高效液相色谱-串级质谱联用法检测植酸酶N-糖基化位点的有效性,并为植酸酶的糖基化研究提供了新的基础. 相似文献
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