日本脑炎病毒受体功能缺陷细胞与亲代细胞膜分子差异的鉴定

鉴定日本脑炎病毒（JEV）受体功能缺陷细胞3A10-3F与亲代细胞BHK-21膜分子表达的差异,以发现JEV受体候选分子。3A10-3F与BHK-21细胞膜蛋白用氯仿去脂法分别提取,通过二维电泳（2-DE）分离。经ImageMaster2D软件分析比较后,选取差异点做液质联用质谱分析（LC—MS／MS）。发现有23个蛋白点在两组2-DE凝胶中有显著差异表达,LC-MS／MS鉴定了14个蛋白质,其中有4个膜蛋白,即钙结合蛋白annexin1,annexin2;电压依赖的离子通道（VDACs）蛋白VDAC1,VDAC2。上述结果为深入鉴定JEV受体分子特性与功能,阐明JEV致病机理提供了线索。     

乙型脑炎病毒E蛋白Ⅲ区基因的克隆表达及亲合层析纯化

克隆表达JEVE蛋白Ⅲ区基因,序列测定正确后进行融合表达、纯化。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）从JEVcDNA中扩增Ⅲ区基因,用限制性内切酶消化后插入到PMD-18T载体,序列测定正确后,再亚克隆到融合表达载体pET32a中。转化大肠杆菌BL21（DE3）,目的基因经IPTG诱导,由T7启动子调控表达了氨基端带6个连续组氨酸残基的JEVEⅢ区蛋白。在变性条件下对目的蛋白进行纯化,获得了融合6个组氨酸残基的JEVEⅢ区蛋白,蛋白纯度大于80%。证实构建了JEVEⅢ基因的重组表达载体,并获得了高纯度的融合表达蛋白,为以后的深入研究奠定了基础。