棉花胞质雄性不育育性恢复基因的RAPD-PCR标记筛选

棉花具有十分明显的杂种优势,利用棉花杂种优势已成为一种提高产量、品质和抗病性的有效途径。目前国内外都十分关注棉花胞质雄性不育系的研究和利用。60年代以来,Meyer等人先后培育了具有异常棉(G.anomalum)、亚洲棉(G.arboreum)、哈克尼西棉(G.harknessii)胞质雄性不育系,并实现了三系配套。印度用哈克尼西棉胞质不育系筛选出杂种棉组合MECH4在生产上利用。最近Stewart(1992),贾占昌(1990),周世象(1992,私人通讯)也分别选育出了三裂棉(G,trilobum)、陆地棉、海岛棉(G.barbadense)胞质不育系。它们的利用价值尚待进一步研究。南京农业大学棉花遗传育种室对我国现有的3种棉花细胞质雄性不育系进行了多学科的理论研究。鉴于目前国内外现有的不育系、恢复系的产量都比较低,不易选育出高产的胞质雄性不育杂种棉这一现状,从90年代初也开始了大规模的不育系、恢复系回交转育工作。为了提高恢复系选育的效率,更是为了筛选步移克隆Rf基因分子探针,我们开展了我国棉花104-7A胞质雄性不育育性恢复基因RAPD-PCR标记的筛选研究。本文是棉花重要农艺性状分子标记(RFLP或RAPD-PCR)筛选成功的首次报道。     

海岛棉Gl2e显性无腺体基因的精细定位

Gl₂^e基因是控制棉花植株和种子无腺体的一个基因, 是低酚棉育种中一个重要的基因资源. 本研究利用陆地棉遗传标准系TM-1和海岛棉无腺体突变品系海1构建的1599个F₂单株, 对无腺体突变基因Gl₂^e进行了精细定位. 遗传研究进一步证明, 该基因是一不完全显性单基因. 结合本实验室的棉花海陆种间遗传连锁图谱, 利用SSR标记将Gl₂^e基因定位在CIR362和NAU2251b, NAU3860b, STV033之间, 遗传距离分别为9.27和0.96 cM.     

染色体重排引起转基因双价抗虫棉变异

在我国自己培育的转Ｂｔ＋ＣｐＴＩ双价抗虫棉Ｔ４纯合后代中获得了一株畸形突变株,它的株型小,雌雄不育,减数分裂也不正常,细胞学研究表明抗虫突变株发生染色体变异导致形态变异,抗虫性分析和ＰＣＲ检测结果均揭示出,该突变的发生不影响希虫蛋白基因的正常表达,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ分析结果进一步证明,该突变株可能发生了染色体缺失或外源基因插入位点转移,在纯合的转基因后代中,染色体结构再发生重排的现象还不多见。     

转蚕丝心蛋白基因改良了棉花纤维品质

利用农杆菌介导法将蚕丝心蛋白基因(fibroin)导入陆地棉品系WC, 共获得了9块愈伤组织系的30株再生植株. PCR检测、卡那霉素抗性筛选和GUS组织化学分析均为阳性的有17株. 经连续4代的卡那霉素抗性筛选和PCR检测, 在T₃代获得了6个转化事件的转基因纯系. Southern blot和Northern blot结果表明, fibroin已整合到6个纯合株系基因组, 且能稳定遗传和表达. 扫描电子显微镜和纤维品质检测结果显示, 所有转基因纯合株系棉纤维的转曲数和纤维伸长率比对照明显增加, 部分株系比强度提高, 说明蚕丝心蛋白基因在棉纤维中特异表达影响了棉纤维的结构和品质, 可以获得纤维品质改良的株系, 有望在生产上得到应用.     

海岛棉EST-SSRs分布特征及新标记的开发与利用

SSRs标记已成为目前应用最为广泛的一种分子标记. 相较之其他棉种, 海岛棉的ESTs及SSRs标记资源均相当匮乏. 本研究利用本实验室2个纤维cDNA文库随机测序获得的海岛棉ESTs序列, 进行海岛棉EST-SSRs分布特征分析及新SSRs标记开发与应用研究. 通过对9697条非冗余ESTs序列分析, 共发现SSRs位点638个, 分布于595条ESTs中, EST-SSRs序列的频率是6.13%, 平均相隔10.4 kb出现一个SSR. 在2~6 bp的重复基元中, 三核苷酸重复基元的SSRs出现频率最高(26.6%), 其次是六核苷酸重复(26.0%)和五核苷酸重复(25.9%). 在所有重复基元类型中所占比例最大的是(AAG)_n. 利用Primer3及virtual PCR程序开发SSRs引物, 并去除来源于海岛棉自身部分同源序列以及与CMD释放的不同棉种冗余SSRs引物后, 获得380对棉花新SSRs引物. 进一步对本实验室四倍体作图亲本陆地棉TM-1和海岛棉海7124进行多态性检测, 其多态率为25.8%. 利用BC1作图群体, 将来源于82对引物的95个多态位点定位在我室构建的海陆遗传图谱上, 其中42个定位在At亚组, 53个定位在Dt亚组. 研究结果为进一步饱和棉花遗传图谱以及开展基于图谱的比较基因组研究奠定了基础.     

陆地棉红株基因(R1)的精细定位

利用陆地棉遗传背景的海岛棉染色体16置换系材料Sub16和陆地棉多基因标记系T586创建了含1259个单株的F₂作图群体, 结合本实验室最新的栽培四倍体棉种种间分子遗传图谱上染色体16的标记信息, 利用分子标记技术, 对红株基因R₁进行精细定位. 在F₂分离群体中, 红株性状分离比符合孟德尔1:2:1的分离, 进一步证明该性状是由一不完全显性单基因控制. 利用JoinMap 3.0连锁分析软件, 使用含237个单株的F₂小群体完成红株基因R₁的初级定位, 进一步利用含1259个单株的F₂大群体将该基因精细定位在NAU4956和NAU6752之间, 与最近标记的遗传距离为0.49 cM. 研究结果为进一步克隆该基因及培育红色彩棉转基因品种提供了研究基础.     

我国现有的3类转Bt基因抗虫棉品系棉铃虫抗性的遗传分析

我国主有要３类转Ｂｔ基因抗虫棉,都已培育出品种或杂交种并在生产上推广利用。遗传分析表明,山西９４－２４、中心９４和Ｒ１９３类转Ｂｔ基因抗虫棉亲本品系对棉铃虫的抗性各由－对显性主基因控制,它们的抗虫基因非等位。山西９４－２４与Ｒ１９的Ｂｔ基因可能整合在陆地棉品种的同一梁色体上,表现为连锁遗传,山西９４－２４、中心９４、Ｒ１９３个抗虫棉品系间互交杂种抗虫性与亲本类似,表明抗虫基因在杂合状态下无共抑制现     

陆地棉遗传标准系TM-1背景的海岛棉染色体片段置换系的培育

染色体片段置换系(chromosome segment substitution lines, CSSL)基因组内只含有一个来自供体亲本的染色体片段, 而基因组的其余部分与轮回亲本相同, 并能把QTL拆分为单个的孟德尔因子, 因此CSSL是进行基因组分析, 特别是QTL分析的理想材料. 本研究以陆地棉遗传标准系TM-1为受体亲本, 海岛棉海7124为供体亲本在BC₅S₁代借助分子标记辅助选择(marker-assisted selection, MAS)培育了一套染色体片段置换系. 这套置换系由330个株系构成; 1~4个不同的株系携带相同的染色体片段, 置换片段的平均长度为10.9 cM, 总长度为5271.9 cM, 是棉花基因组总长度3514.6 cM的1.5倍. 每个株系内被替换的染色体片段长度不一, 最短为3.5 cM, 最长为23.2 cM. 由于还有些区段缺失供体亲本的染色体片段, 所以这个替换系群体没有完全覆盖棉花基因组.     

雷蒙德氏棉EST-SSRs分布特征及开发与利用

微卫星或简单重复序列(simple sequence repeats, SSR)存在于表达序列标签(expressed sequence tags, ESTs)中. 为了在棉花中开发EST-SSR功能性标记, 利用生物信息学方法对NCBI网上公开的63485条雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii Ulbrich) ESTs序列进行EST-SSRs特征分析. 剔除冗余序列, 得到非冗余序列58906条. 在非冗余序列中发现含不同重复基元SSRs的EST序列有2620条, 共2818个EST-SSRs, EST-SSRs序列的频率是4.45%, 平均相隔14.8 kb出现一个SSR. 在1~6 bp的重复基元中, 三核苷酸重复基元的SSRs出现频率最高(38.31%), 其次是二核苷酸(24.09%)、单核苷酸(23.35%). 对所有的重复基元类型进行统计分析发现, 所占比例最大的是A/T(18.67%), 其次是AT/TA(14.83%). 在复合型(compound)中发现三核苷酸串联三核苷酸的重复基元出现频率最高, 为48.65%. 利用Prime 3 软件, 设计了1554对EST-SSRs引物, 随机选用300对对本室四倍体作图亲本陆地棉TM-1和海岛棉海7124进行多态性检测, 其中129对有多态性, 多态性频率为43%. 这些EST-SSRs将有效用于不同棉种间的分布特征比较及染色体定位等方面研究.