双标记选择载体转染牛胎儿成纤维细胞方法的建立

以经SspI和BamHI对所构建的双标记选择载体质粒pCE-EGFP-IRES-Neo-dNdB双酶切后的线性目的DNA为外源基因,对电击介导的牛胎儿成纤维细胞基因转染方法的效率进行了优化.实验结果表明,当电场强度为1.2kV/cm、脉冲时间为1ms时可获得约50个阳性细胞克隆/10 5 个细胞的最佳转染效率.通过牛胎儿成纤维细胞对不同浓度G418抗性的敏感性实验确定800μg/mL G418为快速筛选浓度,以300μg/mL G418为维持筛选浓度.从两个牛胎儿成纤维细胞系中共分离了56个绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞克隆,从中选取2个冷冻保存.经PCR检测,证实2个冷冻克隆株均含有所转染的外源基因.     

转基因小鼠乳腺表达重组人溶菌酶

人溶菌酶是由130个氨基酸组成的碱性多肽, 具有抗菌、抗病毒和增强免疫力的功能, 对生物体的自身防御起着重要作用. 为研究乳腺生物反应器表达重组人溶菌酶和提高牛奶的免疫活性, 制备了以溶菌酶基因组序列为目标基因的表达载体的转基因小鼠模型. 经转基因小鼠的制备, 通过PCR和Southern blot 检测, 从83只出生小鼠中获得6只整合人溶菌酶融合基因的转基因小鼠. 对F1代小鼠的PCR检测表明外源基因可以遗传给后代. 在3只转基因阳性母鼠的乳汁中, 用Western blot方法可以检测到重组人溶菌酶的存在, 最高表达量达到0.2 mg/mL. 经活性检测, 转基因小鼠乳清的溶菌酶活性显著提高, 已达到人乳清溶菌酶活性的0.4倍, 而非转基因小鼠乳清具有极低的溶菌酶活性. 尽管转基因小鼠乳清中重组人溶菌酶活性还低于人乳清中溶菌酶活性, 但是转基因小鼠乳汁中的重组人溶菌酶与人溶菌酶具有相同的比活力. 为乳腺生物反应器表达重组人溶菌酶的研究和开发应用打下了坚实的基础.     

利用体细胞核移植技术生产转基因牛

通过电穿孔的方法, 将含有新霉素抗性(Neo^r)基因和增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的双标记选择载体导入胎牛输卵管上皮细胞, 获得了转基因细胞株. 以转基因细胞为核供体, 进行了牛的体细胞核移植. 重构胚胎424枚, 其中208枚体外发育至囊胚, 囊胚发育率为49.1%. 选择第7天转基因囊胚17枚移入17头同期发情的受体牛子宫角内, 共有5头受体牛妊娠, 妊娠率为29.4%. 经过正常的体内发育, 有3头转基因克隆牛出生, 产犊率为17.6%. PCR和Southern检测结果表明, 3头转基因克隆牛的基因组中都整合有外源目标基因. 并且, 绿色荧光蛋白在转基因克隆牛的耳部皮肤组织以及从耳部皮肤组织分离出的成纤维细胞中均有表达. 上述结果显示, 通过体细胞核移植技术可以有效生产转基因牛; 所构建的双标记选择载体可以有效筛选出转基因细胞和转基因克隆胚胎, 应用于转基因克隆动物的生产, 确保所培育的克隆动物均为转基因动物.     

猪腮腺分泌蛋白基因序列和蛋白结构比较分析及组织表达谱鉴定

腮腺分泌蛋白(parotid secretory protein, PSP)是唾液中特异性高表达的一种蛋白, 其功能与抗菌有关. 根据人、牛和鼠的PSP基因cDNA序列设计简并引物, 通过3′和5′RACE获得猪PSP基因全长cDNA序列. 同源性分析表明, 在核苷酸和氨基酸水平上, 猪、人和牛PSP基因同源性较高. 在蛋白二级和三级结构上, 猪与人PSP的结构也非常相像, 与抗菌蛋白BPI结构类似. 蛋白功能分析发现, 猪PSP基因氨基末端含有一个特殊结构Leu-X(6)-Leu-X(6)-Leu-X(7)-Leu-X(6)-Leu-X(7)-Leu-X(6)-Leu-X(6)-Leu, 可能对其功能有一定的意义. 通过RT-PCR, 斑点杂交和Northern杂交, 证明猪PSP基因是组织特异性表达, 只在腮腺和下颌下腺表达.     

牦牛kappa-酪蛋白基因第4外显子的克隆测序及多态性研究

依据普通牛的kappa-酪蛋白基因序列设计引物进行PCR扩增,测定了牦牛kappa-酪蛋白基因第4外显子全序列及部分第4内含子序列,用HindⅢ和PstⅠ切割PCR产物发现,在牦牛群体中具有和普通牛相同的单倍体型.进一步对60个牦牛个体进行群体分析后发现,牦牛群体中的基因频率和基因型频率与普通牛的群体有着很大的差异.