利用TIRFM技术检测PC12细胞中类突触小囊泡的锚定和融合特性

受到广泛关注的神经递质的释放是通过突触囊泡与突触前膜的融合完成的．通过对单个囊泡动力学的分析发现，在突触囊泡分泌过程中除了“完全融合”（fullfusion）模式外，还存在着“部分融合即离开”（kissandrun）和“部分融合且停留”（kissandstay）两种融合模式．在神经元受到强烈刺激时，这两种分泌模式尤为重要．同时突触囊泡融合前的转运、锚定、激活过程在神经递质的释放和调节过程中起着很关键的作用．在高l（＋刺激下的PCI2细胞中，我们运用全内反射荧光显微镜（total internal reflection fluorescence microscopy，TmFM）技术，通过VAMP2．pHluorin和VAChT-TDimer2双色荧光成像的方法跟踪类突触小囊泡（synaptic vesicle-1ike microvesicles，SLMVs）的锚定和融合过程．结果表明，在高K^＋刺激的PC12细胞中，部分融合即离开这种分泌模式占主导地位，同时发现在高K^＋刺激下SLMVs在细胞膜上的停留时间增加了，说明被激活囊泡的囊泡数量增加．     

一种新型单个神经细胞的RT-PCR技术研究

提出一种新型可重复实现单细胞的RT-PCR的实验技术,扩增目的基因.应用玻璃微电极提取单个神经细胞,裂解获得mRNA,利用RT-PCR技术检测单个神经细胞的离子通道等基因的表达.应用此技术可以灵敏地检测特定电生理现象的分子生物学基础.此法可以比较大鼠背根神经节中大细胞内HCN1的mRNA表达量.实验结果表明:扩增产物的量足够用于后续实验,而且3个重复的均一性也很好,充分表明了该研究提出的实验技术的可行性.     

脂筏特异蛋白荧光标记及在PC12细胞中的功能

采用PCR技术从小鼠cDNA文库中扩增出编码caveolin-1和flotillin-1基因片断,通过TOPO载体将基因克隆到表达载体pEGFP,转化至大肠杆菌DH5α中,抽提、纯化后将重组质粒转入PC12细胞中表达,用TIRFM观察高K 刺激下胞内标记蛋白的动态分布情况.实验结果显示重组质粒caveolin-1-pEGFP和flotil-lin-1-pEGFP在PC12细胞中具有一定的功能,而且caveolin-1和flotillin-1在发挥功能时可能有一个向膜转运的过程.