具有AAV载体包装功能的重组HSV的产生

腺病毒伴随病毒（ＡＡＶ）载体有望成为理想的基因治疗载体,常规的共转染法难以大规模制备重组ＡＡＶ（ｒＡＡＶ）,本研究生产了一种具有ｒＡＡＶ包装功能的重组单纯疱疹病毒（ｒＨＳＶ）,为ｒＡＡＶ的大规模制备提供了新的思路。采用一套含有１型单纯疱疹病毒（ＨＳＶ－１）全基因组的粘粒系统（Ｄａｖｉｓｏｎ ＡＪ ｅｔ ａｌ,１９９３）,该系统含有５个粘粒,依次称为ｃｏｓ４８,ｃｏｓ２８,ｃｏｓ６,ｃｏｓ１４和ｃｓ     

HSV/AAV嵌合病毒法制备rAAV/hFⅨ及其安全性检测

构建了由CMV启动子调控的人凝血因子Ⅸ小基因的重组腺相关病毒载体, 并通过HSV/AAV杂合辅助病毒的方法大量制备成重组腺相关病毒颗粒(rAAV/hFⅨ). 经Southern dot blot及QC-PCR法测定, 滴度达到3.6 × 10¹² vg(病毒基因组)/mL. 将rAAV/hFⅨ病毒以7.5 × 10¹¹ vg/只直接注射到血友病B小鼠股四头肌中, 检测到人Ⅸ因子最高表达量达到387 ng/mL血浆, 持续表达时间12周. 血浆中产生的抗体情况与表达曲线相吻合. 实验结果表明, 采用HSV/AAV杂合辅助病毒法能够有效解决AAV载体的大量制备问题, QC-PCR法检测重组腺相关病毒的滴度比传统的点杂交法更加快速准确. RT-PCR检测表明重组AAV中没有野生型HSV的污染, PCR检测表明重组AAV注射后, 重组AAV病毒仅存在于注射点附近的肌肉中, 未见扩散.     

一种快速高效分离和纯化重组腺病毒伴随病毒载体的方法

利用２型腺病毒伴随病毒（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ２,ＡＡＶ－２）能够抵抗氯仿的特性,采用“氯仿处理－ＰＥＧ／ＮａＣｌ沉淀氯仿抽提”３个步骤分离,浓缩和纯化重组腺病毒伴随病毒（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ,ｒＡＡＶ）,整个纯化过程可在４ｈ内完成,最终从５个转瓶生长的４＊１０＾９个载体生产细胞中可得到５＊１０＾３病毒颗粒／ｍＬ,ＳＤ