结核分支杆菌H37Rv莽草酸脱氢酶基因的克隆、表达及酶学性质的研究

以结核分支杆菌H37Rv基因组为模板,扩增了该菌株的莽草酸脱氢酶基因aroE,通过在大肠杆菌BL21(DE3)pLYS中表达,纯化出可溶性的重组结核分支杆菌莽草酸脱氢酶(SD). 对其酶学性质测定分析表明:在辅酶NADPH作用下该酶可催化还原3-脱氢莽草酸生成莽草酸,最适pH值为11,最适温度为63 ℃,比活性8.26×104 U/mg. Mg2+,Ni2+,Zn2+等金属离子及NP40、TritonX-100等变性剂对其酶活有一定的促进作用,而SDS则强烈抑制该酶活性. 应用圆二色仪初步测定了重组蛋白的二级结构,重组SD的二级结构中大约有29.2%的α螺旋,9.3%β折叠,32.7%β转角,28.8%无规卷曲. 结核分支杆菌H37Rv莽草酸脱氢酶基因的克隆,为该酶的晶体结构分析、免疫学研究及抗结核药物靶点的筛选奠定基础.     

尘肺结核患者Mycobacterium tuberculosis耐药基因突变研究

研究尘肺结核患者结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)耐药基因突变与耐药性的关系。在97例尘肺结核患者痰中检出MTB菌株28株,采用PCR-SSCP法检测katG、rpoB和rpsL基因突变,并与采用常规药敏试验(AST)法检测的耐药结果进行对比分析。采用PCR-SSCP法检测katG、rpoB和rpsL基因,突变率分别为42.86%(12/28)、42.86%(12/28)和32.14%(9/28),采用AST法检测INH、RFP和SM,耐药率分别为64.23%(18/28)、60.71%(17/28)和53.57%(15/28),两者之间差异均无显著性(P>0.05)。其中多耐药株20例(71.43%),包括耐三种药物12例(42.86%),耐两种药8例(28.57%),单耐药株6例(21.43%),敏感株2例,耐药率92.86%。PCR-SSCP法检出3个基因联合突变8株,与AST法符合率为66.67%(8/12);2个基因突变5株,符合率为62.50%(5/8);单基因突变2株,符合率为33.33%(2/6)。结果表明:PCR-SSCP技术适用于MTB katG、rpoB和rpsL耐药基因突变的筛选,对指导尘肺结核患者临床用药上具有重要意义。     

鹿结核病间接ELISA诊断试剂盒的实验研究

对鹿结核病间接ELISA诊断试剂盒进行了系统的实验研究,制备了兔抗鹿酶标抗体;进行了PPD和氯化钾浸出抗原的筛选工作,从而确定了PPD为最佳抗原.通过对抗原最佳浓度和工作条件的摸索,确立了鹿结核病间接ELI SA法的最佳工作条件.可为成功研制出鹿结核病间接ELISA诊断试剂盒奠定了基础.     

结核分枝杆菌不同药物敏感性检测方法的比较

采用比例法和绝对浓度法检测了56株结核分枝杆菌对异烟肼和利福平的敏感性,探讨了比例法和绝对浓度法检测结核分枝杆菌耐药性的一致性和可比性。检测结果显示:2种方法检出的耐药率差异无显著性;用2种方法进行结核分枝杆菌耐药性测定的一致性较高,采用国际通用的比例法,依然具有与我国传统采用绝对浓度法获得的资料数据的可比性。     

卡介苗菌株和结核分枝杆菌H37Ra菌株原生质体的制备研究

分别以卡介苗菌株(BCG)及结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株(H37Ra)为受体菌,制备上述两种菌株的原生质体,同时通过优化细菌菌龄、酶解浓度、酶解温度以及酶解时间等影响因素,探索出制备原生质体形成及再生的最优条件。结果显示:摸索出制备BCG和H37Ra菌株的原生质体条件:在对数生长期的两亲本菌株,经0.01 mol/L EDTA,0.01%β-巯基乙醇溶液预处理;酶解浓度为12 mg/mL,酶解温度为37℃,酶解时间为5 h,可制备出活性较高的两种菌株的原生质体。由此可知,成功制备了BCG与H37Ra菌株的原生质体,并能在高渗固体培养基上再生。本实验为进一步研究该两种菌株原生质体融合试验奠定了基础。     

基于深层迁移学习的DR胸片肺结核病灶检测

针对基于传统机器学习方法设计的DR胸片肺结核检测器存在着泛化能力不强,实际检测精度低等问题,提出了一种基于Focal Loss的深度学习检测方法Tuberculosis Neural Net(TBNN).医学图像的特殊性,存在带标注的数据量小导致无法充分训练深层网络模型等问题.该方法利用肺炎和肺结核同为呼吸道感染疾病且在DR胸片上有相似表征的特点,基于迁移学习原理训练特征提取子网络,减少肺结核胸片样本不足对模型训练造成的影响.首先在大型的肺炎胸片数据集上训练特征提取网络,以获取DR图像中丰富的深层图像语义信息,然后使用样本较少的肺结核数据集微调网络参数,并将多层卷积的输出作为TBNN分类子网络的输入,得到基于DR胸片的肺结核病灶检测模型.实验结果表明,该方法生成的检测模型在分类精度和性能上均优于基于传统机器学习的肺结核检测器.在同等训练数据量和训练周期下,模型性能高于其他采用传统数据增强方法的深层网络肺结核检测算法,且能标识病灶区域,准度上有不低于放射科阅片医生的表现.     

红豆杉内生真菌Fusarium solani B2-1萘酮类代谢产物研究

从红豆杉中分离得到一株内生真菌Fusarium solani B2-1,经大米固体发酵以后,从乙酸乙酯提取物中分离得到4个萘酮类次级代谢产物1～4,鉴定为Dihydronaphthalenone(1)、5-Hydroxydihydrofusarubin C(2)、镰红菌素(3)和Chrysanthones B(4).其中,化合物4为首次从镰刀霉属(Fusarium)真菌中分离得到.化合物1～4具有微弱的抑制海分枝杆菌Mycobacterium marinum ATCCBAA-535增殖活性,浓度为10 μg/mL下的抑制率分别为27.6%、25.0%、28.4%和24.4%.     

综合医院肺结核病诊断要素探讨

目的 :总结综合医院肺结核诊断的经验 ,探索在诸多临床和实验室诊断因素中哪些是重要因素。方法 :收集本院1999年临床疑诊为肺结核患者 30例 ,其中确诊为肺结核 16例 ,非肺结核 14例 ;记录每例患者的 15个病史特征因素和 14个实验室特征因素以及最终诊断。将以上资料作对数优势线性回归分析、单因素 χ2 分析和诊断筛查试验分析。结果 :多因素分析中发现 X线胸片上野淡薄云雾影最重要 ,痰菌涂片次之 ,发热第三 ;单因素分析中发现 X线和痰菌涂片仍有意义 ,而发热却没有临床意义 ;诊断筛查试验分析也说明 X线胸片的正确率最高 ,痰菌涂片次之 ,发热的正确率最低 ;在涂阳结核和涂阴结核之间 ,以上三因素无明显差别。结论 :在综合医院的肺结核诊断工作中 X线胸片的表现是重点 ,其次是痰菌涂片 ,而痰菌涂片的临床表现的特异性最差 ;在综合医院仍然需要开展结核杆菌的培养工作 ;在未来的工作中应建立适应我国国情的肺结核诊断评分系统 ,使肺结核的诊断由经验走向循证     

分枝杆菌噬菌体 D29的生物学特性研究及其抗耐药结核潜力的探讨

目的研究分枝杆菌噬菌体 D29的生物学特性,为 D29抗耐药结核治疗奠定基础.方法观察噬菌体电镜结构和噬菌斑形态;测定 D29最佳感染复数(MOI);一步生长实验;检测 pH值对 D29活力的影响;斑点法测定裂解谱;中和实验检测抗原性.结果 D29噬菌斑圆形透明,边界清楚;D29尾长129nm,最佳 MOI为10-4;D29感染宿主菌的潜伏期约为50min,裂解量为10;pH值对 D29存活率影响大,酸性环境不影响 D29裂解能力;D29能裂解分枝杆菌临床耐药株;D29K值为1069.50.结论 D29属于长尾噬菌体科(siphoviridae),裂解谱广,抗原性较高,具有抗耐药结核潜力     

结核分枝杆菌Ag85B-ESAT6融合蛋白稳定表达细胞系的建立

建立了能够稳定表达结核分枝杆菌Ag85B-ESAT6融合蛋白的P815细胞系。将Ag85B和ESAT6基因分别克隆至真核表达载体pcDNA3,构建了Ag85B—ESAT6融合蛋白的真核表达质粒Ag85B-pcDNA3-ESAT6。在阳离子聚合物作用下,重组质粒转染与BALB／c遗传背景一致的P815（H-2^4）细胞。通过G418压力筛选后,得到1株阳性克隆细胞。经过RT-PCR检测到该细胞中有Ag85B-ESAT6融合蛋白mRNA表达,用间接免疫荧光可以在转染重组质粒的P815细胞膜上检测到较强的绿色荧光,证实P815细胞内有融合蛋白的表达。获得表达Ag85B-ESAT6融合蛋白的稳定细胞系。