Red/ET重组AHBA生物合成基因簇打靶载体的构建与鉴定

为确定3-氨基-5-羟基-苯甲酸(AHBA)生物合成基因簇在链霉菌中与次生代谢产物的关系,运用PCR技术,从33株AHBA合酶基因阳性菌株扩增与AHBA生物合成基因簇中编码AHBA合酶(A)、氧化还原酶(O)、磷酸化酶(P)基因,获得24株AOP基因阳性菌株.根据靶基因A基因下游和P基因上游同源序列设计50 bp引物,中间插入卡那霉素抗性基因的DNA片段,进行PCR,获得外源DNA片段.经过电转化,将外源DNA片段和pKC1139-AOP重组质粒共转入含重组酶质粒大肠杆菌HS996/ pSC101-BAD-gba-(Tet).在Red重组酶的作用下,外源DNA片段与重组质粒pKC1139-AOP上的AHBA基因簇的同源区域重组,构建了AHBA基因簇打靶载体.研究显示了Red/ET重组工作效率高、操作简单、精确的优点,可大大缩短构建打靶载体的时间.     

基于表达序列标签的萝卜ACA36基因簇鉴定

利用国际公用的表达序列标签（EST）数据库资源,运用生物信息学分析方法,在萝卜（Raphanus sativus）一条表达序列标签中发现一个新的snoRNA基因簇。此基因簇含有一个box H/ACA snoRNA基因和两个box C/D snoRNA基因,分别命名为RsACA36、RssnoR66和RsSNORD88。ACA36可形成典型的box H/ACA snoRNA双茎环二级结构;snoR66和SNORD88都具有典型的C盒与D盒保守元件,末端存在反向互补序列;三个snoRNA都含有能和核糖体RNA互补配对的反向互补序列。RsACA36和RsSNORD88均为在植物中首次发现。基于EST数据库、运用生物信息学方法鉴定snoRNA基因既保留了计算机RNA组学快捷、高效的优点,又使结果因为有了实验支撑而更直接、可信。     

聚合酶链式反应递缩基因组文库以克隆抗生素生物合成基因簇

在克隆阿维菌素(avermectin)生物合成基因簇的过程中,探索出了一条运用聚合酶链式反应(PCR)扩增技术对链霉菌基因组文库进行递缩法筛选、以克隆抗生素生物合成基因簇的新方法.依次以96孔培养板整板混合质粒、单排混合质粒和单个菌落为模板进行PCR扩增,以逐步递缩的方式定位包含目的基因的克隆.结果表明,与传统的菌落原位杂交方法相比,该方法具有简单、快捷、准确率高等优点.     

两种相邻分布的水稻U14 BoxC/D snoRNA

通过对酵母U14BoxC/DsnoRNA保守元件的分析,推测出水稻BoxC/DsnoRNA可能具有的保守序列,进而在水稻第二号染色体上找到可能编码两种BoxC/DsnoRNA的序列.这两个BoxC/DsnoRNA在染色体上相邻分布,具有典型的BoxC和BoxD序列,末端形成茎环结构,这也是BoxC/DsnoRNA一个显著的特点.它们含有一段相同的“引导”序列,此序列能与水稻18S核糖体RNA(rRNA)第414位到第427位互补配对,这两者可能行使相同的功能:介导此配对区域内rRNA的核糖的甲基化.通过实验证明:(1)水稻18S核糖体RNA的配对区域内的确存在甲基化修饰;(2)这两种BoxC/DsnoRNA存在于水稻细胞中.通过序列同源性比较发现与玉米U14snoRNA有很高的同源性.将这两种在水稻中发现的BoxC/DsnoRNA命名为U14.1snoRNA和U14.2snoRNA.编码这两种BoxC/DsnoRNA的基因已被GenBank收录,其编号为AF332622.     

核仁小分子RNA基因的起源初探

通过分析、比较含ＢｏｘＣ／Ｄ和含ＢｏｘＨ／ＡＣＡ这两类ｓｎｏＲＮＡ的一些代表与几种剪接体ｓｎＲＮＡ的序列和二级结构特征，研究它们的进化关系，并探讨ｓｎｏＲＮＡ是起源于内含子还是后来才插入到内含子中这一与ｓｎｏＲＮＡ的起源密切相关的问题．结合对剪接体ｓｎＲＮＡ起源的有关研究，提出两类ｓｎｏＲＮＡ最初是起源于原始Ⅱ类内含子中的不同部分的观点．     

二十四元大环内酯生物合成研究进展

二十四元大环内酯Macrolatins对大部分革兰氏阳性菌和阴性菌具有显著抑制活性,在疾病治疗、农业病虫害防治等领域具有潜在的应用价值。但野生菌株代谢产生的二十四元大环内酯产量较低,不利于该类化合物的进一步研究。基于此,本文介绍了二十四元大环内酯生物合成基因簇、基因簇重构、工程菌株构建和发酵优化方面取得的研究成果,简要分析二十四元大环内酯生物合成所面临困境以及下一步研究应该重点关注的方向,为其进一步研究和开发利用提供参考依据。     

小鼠β-簇珠蛋白基因LCR调控元件中DNase-I超敏感点Ⅲ(HS3)的研究

人与小鼠β-簇珠蛋白基因在结构与表达模式上存在极大的相似性.基因簇5’上游20kb内是一个Locus control region(LCR)顺式元件,由4个DNase-Ⅰ超敏感区(HSs)组成.相关的研究工作表明LCR对β-簇珠蛋白基因的红系组织专一性表达有重要作用,它的插入或缺失突变将导致基因表达的紊乱,甚至造成严重的贫血症状.近年来,人们对研究LCR调控元件在β-簇珠蛋白基因发育时期特异性表达中的调控机制给予了极大的关注.希望了解LCR元件中不同的HS是否参与β-簇珠蛋白基因的时期特异开关调节.转基因小鼠研究结果表明人LCR元件中HS3可能与发育早期的胚胎型珠蛋白基因的表达调控相关,但近来有关报道表明小鼠的HS3不为β-簇珠蛋白基因的开关所必需,并且仅部分参与了成年型的β-簇珠蛋白基因的调控.因此,HS3是否参与β-簇珠蛋白基因发育时期特异性的调控尚不完全清楚.     

粟酒裂殖酵母中3个新的box H/ACA snoRNA的鉴定及意义

真核生物rRNA和snRNA中特定位点的假尿嘧啶化修饰是由box H/ACA snoRNA指导的, 这些RNA通常具有保守的H和ACA元件以及“发夹-铰链-发夹-尾”的二级结构. 通过筛选cDNA文库, 从粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中鉴定了3个新的box H/ACA snoRNA, 分别命名为SP12, SP16和SP20. 这些小分子RNA 3′末端都具有ACA类元件, 其二级结构中包含2或3个较大的类似发夹的结构. 尽管SP20 的H元件并不典型, 但能折叠成典型box H/ACA snoRNA的二级结构, 推测其具有指导18S rRNA上U1208和U1053两个位点的假尿嘧啶化修饰的功能. 相反, SP12和SP16的二级结构不同于SP20, 并且也没有与rRNA或snRNA互补的反义元件, 所以被称为“功能未知的向导snoRNA(orphan guide RNA”, 其功能尚有待阐明. SP12和SP16的基因都位于2个编码蛋白质基因的间隔区, SP16 snoRNA是从一个较大的RNA前体剪切加工而来. 有趣的是, SP20基因位于一个预测的蛋白质基因的编码区中, 但转录方向相反. Northern杂交和RT-PCR分析都无法检测到该蛋白质基因的mRNA, 表明该基因在细胞中的表达是不存在的. 这是粟酒裂殖酵母中一个推测编码蛋白质的基因位点反向编码一个小分子RNA的首次报道.     

乳腺癌中hsa-miR-17-92基因簇及其旁系同源体的共调控作用

hsa-miR-17-92基因簇高度保守,可以作为抑癌基因抑制乳腺癌细胞的增殖.包括2个旁系同源体:miR-106a-363和miR-106b-25基因簇,其序列高度相似,可能通过调控共同靶基因而具有相似的功能.探讨3个基因簇转录的15条microRNA的序列特征,以及共调控靶基因在人类乳腺正常和癌细胞系中的表达;并进一步就显著差异表达基因进行GO和Pathway(KEGG)分析.结果表明,超过75%(178/236)的共调控靶基因表达具有显著差异性,这些基因可能与生物体的细胞代谢、转录后调控、生物合成等多种生物学过程有关,参与细胞周期,癌症等信号通路.分析发现乳腺特异基因PTPN4在乳腺癌中的低表达影响蛋白磷酸化水平和细胞周期,SMAD4、CCND1和E2F1作为与细胞周期相关基因在细胞的G1期起重要作用,它们的低表达阻止细胞从G1期进入S期,从而抑制癌细胞的生长,起到抑癌作用.特别是,一方面基因簇调控CCND1和E2F1使其低表达,另一方面它们作为转录因子结合到基因簇的启动子区诱导基因簇表达,从而形成负反馈调控循环调控下游基因表达.