定点突变内皮抑素Zn2+的结合位点及突变基因的克隆表达

从人胚肝组织中提取总RNA, 以逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）法获得人内皮抑素编码序列, 采用定点突变技术将His2和His4双突变为Leu2和Val4. 将突变基因cDNA插入含有T7启动子的质粒pET-28b中构建表达质粒pMendo, 转化大肠杆菌BL21(DE3), 筛选表达菌株BL21-Mute, 表达菌株经IPTG诱导后以包涵体方式产生大量内皮抑素突变蛋白. SDS-PAGE分析表明, 表达的重组蛋白占菌株可溶性蛋白质的30%. 复性、 纯化的内皮抑素突变蛋白纯度达到98%, 失去抑制人脐静脉内皮细胞增殖的活性.     

植酸酶基因表达与调控机制研究(Ⅱ)──番茄幼苗cDNA文库构建与植酸酶基因筛选

采用异硫氰酸胍法从发芽３～４ｄ的番茄幼苗中提取出总ＲＮＡ,用Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）纤维素亲和层析分离纯化ｍＲＮＡ．以ｍＲＮＡ为模板,Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）为引物用逆转录法合成双链ｃＤＮＡ．将ｃＤＮＡ与ＥｃｏＲＩ接头连接后克隆到表达载体λｇｔ１１的单一ＥｃｏＲＩ位点,经体外包装后感染宿主菌Ｙ１０９０,成功地构建了完整的番茄幼苗ｃＤＮＡ文库．用颜色筛选法筛选重组子,然后用植酸酶抗体做探针进行免疫筛选,得到两个阳性克隆．挑取阳性克隆噬菌斑扩增后纯化ＤＮＡ,经琼脂糖凝胶电泳鉴定,显示确有外源ＤＮＡ存在．该插入片断序列测定正在进行．     

乳酸菌表达质粒的构建

粪肠球菌是乳酸菌的一个属．采用生物信息学方法,预测了粪肠球菌AS1．2984基因组中乳酸脱氢酶和三磷酸甘油醛脱氢酶的组成型启动子序列．设计引物通过PCR扩增得到这2段启动子序列,并克隆到乳酸菌一大肠杆菌穿梭质粒pNZ8037上,在启动子下游接上绿色荧光蛋白基因作为标记,构建乳酸菌的组成型蛋白表达质粒．通过电转化将上述改造过的pNZ8037质粒导入粪肠球菌中,在共聚焦显微镜中可以观察到绿色荧光蛋白的表达．在乳酸菌MRS培养基中加入乳酸、盐酸、氢氧化钠等试剂,发现可以调节绿色荧光蛋白的表达量．     

不同荧光蛋白基因标记利迪链霉菌

 利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）A01 是一株分离自北京郊区对植物病原真菌具有广谱抑制作用的放线菌,在植物真菌病害防治中具有良好的应用前景。为了检测红霉素启动子在利迪链霉菌A01 中的活性,为后期对菌株A01 进行遗传改造提供技术支持,同时对生防菌A01 进行遗传标记以研究和阐明其在生态环境中的生物学行为规律,本实验采用两亲本接合的方法,将增强绿色荧光蛋白（EGFP）和红色荧光蛋白（RFP）基因片段克隆到携带红霉素启动子（ermE^*）的链霉菌表达载体pIB139 中,成功构建了以egfp 和rfp 为报告基因的重组载体pIB139-EGFP 和pIB139-RFP,并转化利迪链霉菌A01,突变株在荧光显微镜下观察到较强的绿色荧光和红色荧光,同时PCR 鉴定结果正确。这表明重组载体pIB139-EGFP 和pIB139-RFP 成功转入菌株A01,并且ermE^*启动子成功启动egfp 和rfp 基因表达。     

猪SOCS7基因克隆、组织表达图谱分析及剪接变体鉴定

以家猪肌肉来源 cDNA为模板,克隆了 SOCS7的编码区 cDNA 全长并发现了三种剪接变体(命名为：SOCS7-v1、SOCS7-v2和 SOCS7-v3).家猪 SOCS7编码区 cDNA 全长为1785bp,由9个外显子组成,编码含581个氨基酸残基的蛋白质.家猪SOCS7基因的三种剪接变体分别编码含547、520、512个氨基酸残基的蛋白质.通过RT-PCR方法,本研究对家猪SOCS7基因及其剪接变体的组织表达图谱进行了分析,结果显示：SOCS7在精巢、小脑、背肌、腹肌、股肌、大脑、下丘脑、心脏、肝脏、脾脏、小肠等组织中均有表达,在精巢中表达信号最强.SOCS7-v1和 SOCS7-v2除大脑外的19个检测组织中均能检测到较强的表达信号, SOCS7-v3在除精巢外的19个组织中均有表达.以上实验结果为探究家猪 SOCS7基因的生理功能奠定了基础.     

甘蓝型油菜BnbHLH92基因的克隆与表达分析

为研究甘蓝型油菜bHLH转录因子的功能,采用同源克隆技术从甘蓝型油菜中克隆了5个BnbHLH92基因全长cDNA序列,分别命名为BnbHLH92-1、BnbHLH92-2、BnbHLH92-3、BnbHLH92-4、BnbHLH92-5,其编码区长度分别为738,657,684,741,717bp.qRT-PCR实验表明,除BnbHLH92-1外,其它的BnbHLH92基因主要在抽薹期和花期的根中表达,BnbHLH92-1主要在抽薹期和花期的根以及二叶一心期的叶中表达.非生物胁迫显著影响BnbHLH92基因的表达,使其表达量升高.低温胁迫下,BnbHLH92基因分别在胁迫后4、6、6、6、6 h表达量达最高.高温胁迫下,5个BnbHLH92基因分别在胁迫后2、6、6、8、4 h表达量达最高.盐胁迫下,BnbHLH92基因分别在胁迫后6、6、24、24、24 h表达量达最高.在ABA诱导下BnbHLH92基因表达量也有不同程度的增加,分析发现BnbHLH92基因的启动子序列上存在ABA响应元件(ABRE).     

Regulatory effect of cotton leaf curl virus AC2 on virion sense promoter

The AC2 gene of cotton leaf curl virus (CLCuV) was obtained by polymerase chain reaction (PCR) . The total DNA of the CLCuV infected tomato leaves was used as template, and the amplified DNA fragment was inserted into a cloning vector. Transient expression vectors were constructed by inserting the AC2 gene into downstream region of CaMV 35S promoter. These constructs were delivered into tobacco and cotton leaf cells for transient expression by particle bombardment. The results indicated that the virion sense promoter was activated by AC2 and its activity increased remarkably. However, the activity of transactivated virion sense promoter was still lower than that of the complementary sense promoter. The expression pattern of transactivated virion sense promoter was similar to that of the complementary sense promoter, namely with high activity in both mesophyll and vascular tissues. The possibility of application of AC2 in plant genetic manipulation was also explored.     

棉铃虫细胞系SFE—HA—8212的克隆化及对HaSNPV受纳性提高的克隆系的建立

用细胞临界生长密度法对棉铃虫蛹卵巢细胞系ＳＦＥ—ＨＡ—８２１２进行克隆化，获得８株克隆细胞系．各株克隆细胞系各自的形态较为均一，但相互间在形态、生长特性、对病毒受纳性等方面有很大差别，其中一株ＣＳ细胞对棉铃虫单粒包埋型核型多角体病毒（ＨａＳＮＰＶ）的受纳性明显高于ＳＦＥ—ＨＡ—８２１２细胞，形成多角体的细胞比率、多角体的产量、游离病毒粒子的产量及多角体蛋白的产量均有提高，是研究和应用ＨａＳＮＰＶ的有效系统．     

甜菜夜蛾核型多角体病毒vp39基因重组真核表达质粒的构建及鉴定

利用DNA重组技术，将杆状病毒极早期基因iel启动子基因克隆至重组质粒pGEM-Se39中，成功地构建了重组真核表达质粒pGEM-IE1-Se39。     

酒色着色菌Chromatium vinosum膜结合态氢酶基因hupSL的克隆及分析

光合细菌酒色着色菌(Chromatiumvinosum)含有Hup膜结合态氢酶.根据同科的桃红荚硫菌(Thiocapsaroseopersicina)Hup氢酶同源序列,在结构基因小亚基hups和hupC的保守框上设计1对简并引物:Ps:5’CCGACCAC(C/G)TACAACGCCTG3’和Pc:5’CG(G/C)GACATGATGTC(T/C)TCGCG3’.通过PCR扩增获得2.6kb的扩增片段,克隆后进行序列分析.结果表明,该片段包含部分的小亚基hupS序列、大亚基hupL的全序列及hupC部分序列.从已知的hupS序列选取适当位点合成引物AS2:5’CTACGACCATGTCACCGACA3’,并利用接头寡核苷酸序列P6:5’CCTTGTGAAATTGTTATCCGCT3’,通过PCR扩增获得1.2kb的扩增片段,克隆后进行序列分析.结果表明,该片段包含完整的膜结合态氢酶的小亚基基因hupS.