单引物PCR扩增DNA指纹图谱的稳定性研究

以人胶原蛋白基因下游一段ＤＮＡ的互补序列设计引物，对人染色体ＤＮＡ进行单引物ＰＣＲ扩增，在低温退火的条件下，这种引物与ＤＮＡ模板的一处完全配对，并且可以随机地结合在其他一些位置上。由此进行单引物ＰＣＲ扩增，它们的扩增产物形成了稳定的引物－模板特异的ＤＮＡ指纹图谱。本文所建立的单引物ＰＣＲ扩增技术在类似的研究中均可获得稳定的实验结果，具有一定的应用价值。     

Genome sequencing and characterization analysis of a Beijing isolate of chicken coronavirus infectious bronchitis virus

Avian infectious bronchitis virus (AIBV) is classified as a member of the genus coronavirus in the family coronaviridae. The enveloped virus has a positive-sense, single-stranded RNA genome of approximately 28 kilo-bases,which has a 5‘ cap structure and 3‘ polyadenylation tract.The complete genome sequence of infectious bronchitis virus (IBV), Beijing isolate, was determined by cloning sequencing and primer walking. The whole genome is 27733 nucleotides in length, has ten open reading frames:5′-orfla-orflab-s-3a-3b-e-m- 6a-6b-n-3′. Alignments of the genome sequence of IBV Beijing isolate with those of two AIBV strains and one SARS coronavirus were performed respectively. The genome sequence of IBV Beijing isolate compared with that of the IBV strain LX4 (uncompleted, 19440 bp in size) was 91.2% similarity. However, the full-length genome sequence of IBV Beijing isolate was 85.2% identity to that of IBV Strain Beaudette, and was only 50.8% homology to that of SARS coronavirus. The results showed that the genome of IBV has remarkable variation. And IBV Beijing isolate is not closely related to SARS coronavirus. Phylogenetic analyses based on the whole genome sequence, S protein, M protein and N protein, also showed that AIBV Bering isolate is lone virus in group Ⅲ and is distant from SARS coronavirus. In conclusion, this study will contribute to the studies of diagnosis and diseases control on IBV in China.     

不结球白菜SSR引物的高效开发及其通用性研究

利用改进的ISSR-PCR分离不结球白菜基因组微卫星,进行两步PCR,分别设计出SSR两端引物IP2和IP3（即SSR引物对）,SSR引物产率为12%,明显高于传统方法.不结球白菜SSR序列以（GA）n为主,占70%.将69对SSR引物用于芸苔属其它8种作物的扩增,97%引物有显著扩增,扩增率最高的为四倍体白菜和甘蓝（85.5%）,最低的为青花菜（49.3%）.10对为通用引物,在所检测的8种作物中片段大小一致,其余的扩增片段和数目差异较大,表现出较为丰富的多态性.尤其是在C基因组的甘蓝和花椰菜上,最多可检测到5个位点,表明运用lSSR-PCR开发出的引物多态性较高.     

淡水鱼类线粒体DNA D-loop基因的引物设计和应用

 线粒体DNA测序已广泛应用于鉴定和区分种类以及解决系统进化关系问题。本文选取已测定的主要淡水鱼类的线粒体DNA D-loop基因序列进行同源性比较,寻找保守序列,利用简并性原则设计一对通用的简并引物。利用设计的引物对广东省珠江流域主要的淡水鱼类线粒体DNA D-loop控制区基因进行扩增,均能获得单一的目的DNA片断,特异性扩增产物大小为1 kb左右。经测序及与GenBank同源序列的比较,证实为包含线粒体控制区全序列的扩增产物。本研究所设计的引物和应用的方法可以快速地同时对多种鱼类进行大规模的遗传背景分析,鉴定某些难于鉴别的近缘物种,为我国鱼类的种类鉴定、地理种群鉴别及种质资源的评估提供重要的工具。     

乌江流域某水库浮游藻类群落结构及多样性分析

浮游藻类在河流生态系统中发挥着重要的生态功能.为探明乌江流域不同梯级水库中浮游藻类的种群结构特征,采集了乌江流域某水库水深分别为0,10和45 m的水样过滤膜分层样本,利用两对浮游藻类通用简并引物对水样进行23S rRNA基因扩增、扩增片段建库和高通量测序分析.通过对两对引物获得的浮游藻类种群覆盖度比较,选择出了相对高...     

半随机单引物PCR扩增产物的特异性研究

以Ｍ１３ｍｐ１９为模板,寡核苷酸“１２２４”为引物,进行半随机单引物ＰＣＲ扩增;分析其扩增产物的限制性内切酶酶切图谱,推定它们分别在Ｍ１３ｍｐ１９序列中的确切位置;证实引物“１２２４”的３端与模板Ｍ１３ｍｐ１９负链的互补结合,至少需有连续的４上个核苷酸,才能产生单引物ＰＣＲ扩增的模板分子,进行有效的ＰＣＲ扩增,并由此决定了扩增产物中各ＤＮＡ片段的大小及其在模板ＤＮＡ序列中的特定位置。     

志贺氏菌实时荧光单引物等温扩增方法的建立及应用

以志贺氏菌ipaH基因特异序列为靶序列,设计RNA-DNA组合引物和链终止序列,优化反应体系,建立实时荧光单引物等温扩增检测志贺氏菌的方法,反应时间为44min。通过对4株不同群志贺氏菌和12株其他食源性致病菌进行实时荧光单引物等温扩增检测,结果表明,除4株志贺氏菌外,其他细菌均未扩增出荧光曲线。进一步研究表明,采用普通热裂解法提取DNA,实时荧光检测福氏志贺氏菌DNA的灵敏度为1.16fg/μL,纯培养菌液的灵敏度为1.3CFU/mL;对牛奶模拟样品中福氏志贺氏菌的检出限是1.8CFU/mL。研究结果表明,实时荧光单引物等温扩增检测志贺氏菌灵敏度高、特异性强、耗时短、方法简便。     

PCR反应的动力学模拟和相关因素对扩增结果的影响

PCR技术建立二十年以来,它已经成为生物学实验室不可缺少的一部分。但因为其影响因素多、反应过程比较复杂,到今天为止它还是一个具有某种程度经验性的方法。我们从PCR反应的基本动力学过程分析出发,通过每一轮扩增循环的分析描述了产物的积累过程,在此基础上建立了反应的迭代动力学模型。通过该模型我们模拟了反应使用的模板量、扩增循环数、酶的使用量、酶的半衰期、以及每一轮扩增中变性时间对扩增结果的影响。进一步,我们对模板使用量、扩增循环数、酶的使用量对扩增结果的影响进行了实验验证和探讨;混合模板对扩增结果的影响也同时做了探讨。模拟和实验的结果表明:常规的PCR实验中使用中等偏低的模板量,选择较好的聚合酶同时使用合适的酶量,通过较低循环数的扩增就能得到较为满意的结果。PCR实验的成败最大的限制因素是实验准备过程中引物的设计,而实验过程中的调整优化只能起辅助作用。     

铁皮石斛试管苗的RAPD分析及其特异性鉴定引物设计

为了能方便快捷地鉴别出铁皮石斛试管苗和铁皮石斛,采用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对铁皮石斛试管苗及石斛属23个种进行了基因组DNA多态性分析,从中找出铁皮石斛试管苗特征性条带进行克隆和测序,并根据测序结果设计了特异性引物.采用此特异性引物对铁皮石斛试管苗及石斛属其他一些种进行扩增,结果表明,铁皮石斛试管苗与各地产野生铁皮石斛出现同一特征条带,而石斛属其他种未出现该条带.     

甘蓝型油菜Toc33基因启动子的克隆及序列分析

叶绿体是植物细胞中重要的细胞器，大部分叶绿体蛋白质都是由核基因组编码，在细胞质中合成分子量较大的前体蛋白，转运至叶绿体实施其功能．TOC33／TOC34是叶绿体上发现的一个外膜蛋白转运器构件蛋白，它与TOC159、TOC75和TOC64相互作用，构成了叶绿体外被膜上的一个蛋白转运器．目前已从豌豆（Pisumsa tizrurn）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、玉米（Zea mays）、小立碗藓（Physcomitrella patens）、诸葛菜（Orychophragmus violaceus）和油菜（Brassica napus）克隆到TOC33或TOC34的cDNA或DNA的编码区．与其功能研究相比，Toc33基因的表达调控研究较少，该基因5’端调控区域的克隆及序列分析均未见报道．为此，在本实验室已经克隆到甘蓝型油菜Toc33基因编码区的基础上，采用单引物PCR方法进行染色体步移，克隆出Toc33基因的启动子，为进一步研究Toc33基因的转录调控机制奠定基础．