蛇神经毒素在毕赤酵母中的分泌表达及其分离纯化

文中主要研究了毕赤酵母基因工程菌的构建及其发酵表达产物蛇神经毒素的分离纯化条件。蛇神经毒素编码基因由本实验室设计、合成，并重组构建成表达质粒pPIC9k-hPK。经电穿孔将该质粒转化毕赤酵母GS115 (His-Mut+)，筛选His+Muts型菌株，经诱导表达，产物进行SDS- PAGE电泳鉴定，相对分子质量与理论值一致，目标蛋白经小试发酵产量可达350mg/L。利用超滤、离子交换树脂及分子筛分离纯化，产物经高效液相色谱(HPLC)分析纯度达92%。     

重组人VEGF165蛋白在毕赤酵母中高效表达与多克隆抗体的制备

构建pPIC9K-VEGF165分泌型载体,线性化后电击转化至GS115(his4)中,经最小葡萄糖培养基(MD平板)筛选出阳性表达菌株并进行聚合酶链式反应(PCR)验证.菌株发酵上清液经Sephadex G-25,Heparin Sepharose FF和Sephacryl S-100层析介质分离纯化,目的蛋白纯度达到95%,相对分子质量约为24ku.结果表明:重组人VEGF165蛋白能诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖,提高HUVEC细胞的活性;重组人VEGF165蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,间接酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测抗体效价达1:51 200.     

基因重组酵母工程菌优化表达人源胶原蛋白

通过响应曲面法(RSM)优化巴氏毕赤酵母基因工程菌GS115/pPIC9KG6表达高亲水性重组人源胶原蛋白的摇瓶培养条件。采用Box-Behnken设计(BBD)考察初始诱导pH值、温度和甲醇添加量三个主要影响因子对重组人源胶原蛋白表达量的影响,利用DX7Trial软件设计实验方案,根据该方案设置不同培养条件进行实验并测定相关参数。响应面分析确定的最优因素水平组合为:初始诱导pH值为5.0,诱导温度为28℃,甲醇添加量为2.2%/24 h。通过响应面法优化发酵的内在因素水平,找出最佳条件,为利用其指导在发酵罐中进行高密度发酵生产人源胶原蛋白奠定基础。     

两种葡萄糖氧化酶基因分别在酿酒酵母及毕赤酵母中的重组表达

从Aspergillus niger CICC 40179中克隆得到了葡萄糖氧化酶(GOD)基因,并在酿酒酵母AS2.489中通过载体p2μRCMB进行重组表达.合成来源于A.niger的一段GOD基因(美国专利号为5094951),同时对其进行了少量密码子的同义替换以避免部分酶切位点,将该段合成的序列通过甲醇诱导型载体p PICZαA在毕赤酵母X33中进行了重组表达.比较分析两种葡萄糖氧化酶的分泌表达情况.     

SOD-肝素结合结构域融合蛋白的毕赤酵母重组菌株构建及表达

利用基因工程技术将人源Cu, Zn-SOD与EC-SOD的C末端肝素结合结构域（HBD）的编码序列进行密码子优化并人工合成,然后电转化至毕赤酵母进行表达.单因素实验表明,与现有研究的一些重组EC-SOD相比,其比活力提高了1.30～3.78倍.正交分析得最佳摇瓶条件为诱导时间为5 d,初始pH值为5.2,诱导剂量的体积分数为1.0%,酶活可达1 120.2 U?mL^-1,是初始酶活的2.94倍;这些结果表明,SOD-HBD融合蛋白在一定程度上解决了重组EC-SOD表达量低的问题,为重组EC-SOD蛋白的推广与应用提供重要的物质基础条件.     

重组鸡IL-18与新城疫HN基因融合蛋白在毕赤酵母中表达条件的优化

为探索ChMIL18-HN在毕赤酵母中最适宜的表达条件,采用小型摇瓶培养系统,通过对重组毕赤酵母菌X-33/pPICZαA-ChMIL18-HN在不同诱导时间、培养液pH值、甲醇诱导剂剂量及培养温度的条件下表达目的蛋白的分析,以对其表达条件进行优化。结果表明:重组菌X-33/pPICZαA-ChMIL18-HN在pH6.5,甲醇诱导浓度为1.5%,培养诱导温度为30℃的条件下诱导156h,目的蛋白的表达量最高。     

生淀粉结合域SBD及糖化酶基因在毕赤酵母中的融合表达

【目的】研究生淀粉结合域SBD及糖化酶基因在毕赤酵母中的融合表达,提高酶的表达量和水解生淀粉的能力。【方法】利用In-fusionTM PCR克隆技术将淀粉结合域SBD无缝隙插入到黑曲霉糖化酶基因glu的5′端构建融合表达质粒pPIC9K-psg,实现融合酶基因psg在毕赤酵母GS115中的高效表达,并进行酶学性质研究。【结果】融合酶的最适作用条件及热稳定性均与原始酶无明显差别,但反应温度及pH值的范围更为宽泛,在反应温度60~70℃,pH值为4.0~7.0时均较稳定;融合酶PSG降解生淀粉的能力较原始酶PG提高29.6%,比原始菌株提高86.5%。【结论】淀粉结合域SBD的融合提高了糖化酶水解生淀粉的能力。     

猪胃蛋白酶原A在毕赤酵母中的表达

利用已有的猪胃蛋白酶原AcDNA,构建毕赤酵母pPIC3.5K-pA胞内表达载体.经纤维蛋白消化试验和干酪素琼脂平板法筛选,获得两株高表达的重组子,研究它们在不同pH值、不同诱导时间、不同起始浓度和不同甲醇诱导浓度等条件下表达水平的高低.结果表明:在pH值为7、诱导72h、起始诱导浓度的OD600为2、甲醇诱导浓度为1%时,重组胃蛋白酶活力最高,达到6.46U/mL.     

超滤质谱法研究大黄蒽醌类化合物与 人血清白蛋白的相互作用

从重组菌株pPIC3.5 k-MTG/DH5α提取重组质粒pPIC3.5k-MTG,经SacⅠ酶切线性化处理后纯化重组质粒电击转化到毕赤酵母菌中,用甲醇诱导表达,经SDS-PAGE鉴定重组质粒P.pastoris GS115成功表达出了TGase蛋白,并初步纯化获得了较纯的目的蛋白,其表观分子量为47 kD,酶活为0.50 U/mL.     

Hepc 20在毕赤酵母中的胞内表达及鉴定

构建了Hepc 20的毕赤酵母表达载体,在毕赤酵母中能成功表达有活性的Hepc 20。优化了菌株的培养诱导条件,结果表明BMMY培养基是Hepc 20表达和重组菌株生长的最佳培养基,甲醇诱导终体积分数0.5%,在此条件下Hepc 20在重组菌株中的表达量约为3.6 mg/L。Western blot检测显示的22000处的条带为重组Hepc 20条带;ELISA验证表明重组Hepc 20可以跟抗体特异结合,琼脂扩散法抗菌实验表明重组Hepc 20对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌表现出抗菌活性。