南极假丝酵母脂肪酶B在毕赤酵母的表达及酶学性质研究

为提高南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarcticalipase B,CALB)的表达量,根据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子偏好性设计合成CALB基因,插入表达载体pPIC9K构建重组质粒pPIC9K-CALB.重组质粒转化毕赤酵母GS115,经过G418抗性筛选得到多拷贝转化子.摇瓶发酵120 h后上清液酶活力达到46 U/mL,通过金属螯合层析纯化发酵液将CALB纯化了5.23倍,比活力达到856.7 U/mg,去糖基化实验显示重组CALB比野生型CALB大5 ku.实验考察了不同反应温度、pH值和金属离子对重组CALB活性和稳定性的影响,发现重组CALB最适反应温度和pH分别为30℃和6.5,在pH 5.0~8.0之间以及40℃以下有较好稳定性,金属离子(10 mmol/L)Ca2+,Zn2+,Mn2+有助于CALB酶活力的提高,而Cu2+,Ag+,Fe3+强烈抑制酶催化反应.     

重组毕赤酵母体系生成PlUGT1蛋白适宜条件研究

通过单因素试验分别研究pH值和温度对重组毕赤酵母GS115/pPIZA-PlUGT1生长以及甲醇浓度、pH值和温度对诱导表达PlUGT1蛋白的影响.结果表明,pH6.5和30 ℃是培养重组毕赤酵母GS115/pPIZA-PlUGT1最佳的生长条件,重组毕赤酵母GS115/pPIZA-PlUGT1诱导表达蛋白的适宜条件为甲醇体积分数0.5%、30 ℃和pH5.0,该条件下培养72 h,培养液中的蛋白质量浓度为0.721mg/mL.     

小鼠LEAP-2成熟肽基因在毕赤酵母中的分泌表达

实验利用已构建的分泌型重组表达质粒pPIC9-mmLEAP-2,氯化锂转化表达宿主菌GS115毕赤酵母;应用表型和PCR技术筛选高拷贝转化株。经摇瓶发酵和甲醇诱导,SDS—PAGE分析重组mmLEAP-2表达量,为进一步研究mmLEAP-2的活性奠定了基础。     

偏甘油酯脂肪酶PrLip的重组表达及酶学性质表征

偏甘油酯脂肪酶因其独特的底物偏好性具有广阔的应用前景。研究从食品安全菌娄地青霉的基因组中发现了一个假定的偏甘油酯脂肪酶prlip基因,通过全基因合成技术获得该酶基因序列,并构建了PrLip组成型表达的毕赤酵母基因工程菌。工程菌在30℃发酵培养60h,发酵活力达到22.26U/mL。利用阴离子交换层析法纯化,获得纯度大于90%的脂肪酶PrLip。酶学性质研究发现该酶的最适反应温度为45℃,最适反应pH值为7.0,40℃的半衰期为6h,水解及酯化反应证实PrLip是一种偏甘油酯脂肪酶。脂肪酶PrLip具有良好的温度耐受性及对大多数表面活性剂的耐受性,使其具有广阔的工业应用前景。     

黑腹果蝇抗真菌肽基因Drs的真核可溶性表达

将黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）抗真菌肽基因Drosomycin（Drs）克隆到pPICZα-A载体中,构建分泌型表达载体pPICZα-A-Drs,转化宿主菌Pichia pastoris X-33.在 AOX1（醇氧化酶）启动子调控下,抗真菌肽DRS成功表达,其分子量约为5 kD.抑菌试验显示,DRS对供试真菌有明显的抑菌活性.采用考马斯亮蓝法测定抗真菌肽的具体表达量,并优化了诱导条件.     

重构新型血管内皮生长因子在毕赤酵母中的表达、纯化与功能鉴定

血管内皮细胞生长因子为内皮细胞特异的刺激因子,在缺血治疗中具有应用前景.本文通过PCR的方法将VEGF165纤溶酶酶切位点突变并将肝素结合域融合到VEGF165的C末端,且将其进行了酵母表达,并纯化了酵母表达产物,对它的生物活性进行了初步鉴定.结果表明,改构的VEGF可形成蛋白二聚体,且仍保留体外刺激血管生成的能力.VEGF的重构成功与表达产物的获得,为进一步研究其功能奠定了基础.     

解淀粉芽孢杆菌中性植酸酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

采用PCR法从解淀粉芽孢杆菌BA11中克隆到一个中性植酸酶phyc基因,将该基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K上并电转化至宿主细胞GS115后进行诱导表达。SDS-PAGE试验表明:该重组中性植酸酶在毕赤酵母宿主细胞中实现了高效分泌性表达。植酸酶活性测定结果显示阳性克隆子在诱导72h酶活性达到最高值,活性为2330U/L。     

人胰岛素原密码子的优化及其在毕赤酵母中的表达

依据毕赤酵母偏好密码子,设计合成长效人胰岛素原( human proinsulin,HPI)基因序列,所合成的HPI基因全长为200 bp,并在其N端添加信号肽(EEAEAEAEPK)以提高目的蛋白表达.将改造后基因克隆到pPIC9K载体中,构建分泌表达型载体pPIC9K-HPI,转化到毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中.用遗传霉素G418梯度筛选获得高拷贝菌株,在甲醇诱导下表达分子质量为7.87 ku的HPI,利用金属螯合层析纯化蛋白质,胰蛋白酶酶切后利用人胰岛素试剂盒测得生物活性,HPI摇瓶最高产量可达35.4mg/L.该研究为获得大量长效胰岛素基因工程产品奠定研究基础.     

Structure and function of eukaryotic NAD(P)H:nitrate reductase

Pyridine nucleotide-dependent nitrate reductases (NRs; EC 1.6.6.1–3) are molybdenum-containing enzymes found in eukaryotic organisms which assimilate nitrate. NR is a homodimer with an ∼100 kDa polypeptide which folds into stable domains housing each of the enzyme's redox cofactors—FAD, heme-Fe molybdopterin (Mo-MPT) and the electron donor NAD(P)H—and there is also a domain for the dimer interface. NR has two active sites: the nitrate-reducing Mo-containing active site and the pyridine nucleotide active site formed between the FAD and NAD(P)H domains. The major barriers to defining the mechanism of catalysis for NR are obtaining the detailed three-dimensional structures for oxidized and reduced enzyme and more in-depth analysis of electron transfer rates in holo-NR. Recombinant expression of holo-NR and its fragments, including site-directed mutagenesis of key acative site and domain interface residues, are expected to make large contributions to this effort to understand the catalytic mechanism of NR.     

蛇神经毒素在毕赤酵母中的分泌表达及其分离纯化

文中主要研究了毕赤酵母基因工程菌的构建及其发酵表达产物蛇神经毒素的分离纯化条件。蛇神经毒素编码基因由本实验室设计、合成，并重组构建成表达质粒pPIC9k-hPK。经电穿孔将该质粒转化毕赤酵母GS115 (His-Mut+)，筛选His+Muts型菌株，经诱导表达，产物进行SDS- PAGE电泳鉴定，相对分子质量与理论值一致，目标蛋白经小试发酵产量可达350mg/L。利用超滤、离子交换树脂及分子筛分离纯化，产物经高效液相色谱(HPLC)分析纯度达92%。