阿魏酸酯酶O42807在毕赤酵母GS115中的表达

研究阿魏酸酯酶O42807基因(fae)在巴斯德毕赤酵母GS115中的表达及重组阿魏酸酯酶的酶学特性.化学合成fae基因序列,构建分泌型重组质粒pPIC9K-fae,经线性化后电转化至毕赤酵母GS115,对筛选出的高活性转化子进行诱导表达.SDS-PAGE分析显示:发酵上清液为单一条带,表观相对分子质量为42 ku,酶活为78.49 nkat·mL^-1,比活力为524.38 nkat·mg^-1,最适反应温度为50 ℃,在40~45 ℃温度范围内较稳定,最适反应p     

表达人胰岛素前体的毕赤酵母菌株的构建

将人胰岛素前体 (HIP)基因插入到毕赤酵母Pichiapastoris的分泌表达质粒pPIC9K中,得到分泌表达质粒pPIC9K/HIP并用电转化法转化P.pastorisGS115。筛选出整合型His⁺Mut^s 菌株,进一步用G418筛选获得高拷贝转化子。经诱导培养后,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)证明HIP在毕赤酵母中能有效分泌表达。对毕赤酵母中外源基因的稳定性进行了研究,结果表明外源基因在毕赤酵母中很稳定.     

花鳗鲡重组促黄体生成素在毕赤酵母中的表达

 采用聚合酶链反应从花鳗鲡垂体cDNA中分别扩增出GTHα、LHβ基因,再利用搭桥技术,中间以linker将两个基因连接成单个基因LHβα。然后利用双酶切、连接,将LHβα基因连接到载体pPICZαA中,构建出促黄体生成素的酵母共表达载体pPICZαA-LHβα。再利用电转化法将其转入到酵母野生型菌株X-33中,在含不同浓度的zeocinYPDS平板上筛选高拷贝转化子,阳性克隆经φ=0.7%甲醇诱导表达,表达产物采用SDS-PAGE和western blot进行分析,得到所表达的产物相对分子质量约为45 000。     

枯草芽孢杆菌寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因在毕赤酵母中的表达研究

根据枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因序列设计引物,以pHBM003为模板,扩增得到寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因,克隆至毕氏酵母（Pichia pastoris）表达载体pHBM905上,获得重组毕氏酵母表达载体pHBM9053．将此质粒分别转化毕氏酵母GS115、KM71和SMD1168菌株,筛选获得重组毕赤酵母GS115（pHBM9053）、KM71（pHBM9053）和SMD1168（pHBM9053）;然后进行摇瓶诱导培养,这3株毕氏酵母分别在诱导培养60h、48h和24h后,酶活力达到最高,对应为2．233u／mL、0．34u／mL和1．235u／mL;GS115（pHBM9053）所产寡聚-1,6-葡萄糖苷酶的最适反应温度为75℃,最适反应pH值为6,在30～75℃、pH8～9范围内较稳定．     

两种杂合抗菌肽在毕赤酵母中的表达及活性测定

参照毕赤巴斯德酵母(Pichia pastoris)的偏好密码子,改造克隆杂合抗菌肽CA(1～7)M(4～11)和CB(1～7)M(4～11)基因,将改造后的基因克隆到pPICZα-A 载体中,构建分泌型表达载体pPICZα-A-CAM和pPICZα-A-CBM,转化宿主菌Pichia pastoris X-33,在甲醇的诱导下进行表达.实验结果表明,杂合抗菌肽获得表达,两种表达产物具有明显的抗菌活性.此外,本文还比较了二者的抗菌谱,分析了杂合肽的性质,优化了酵母电转化条件.     

大鼠组织型金属蛋白酶抑制剂-1在毕赤酵母中的重组表达

提取SD大鼠肝组织总RNA,通过RT-PCR扩增TIMP-1 cDNA片段.将扩增产物克隆至pUCm-T载体上,PCR、限制性酶切及测序证实后,EcoRI和NotI双酶切pUCm-T-TIMP-1重组体,回收TIMP-1,再将其亚克隆到酵母表达载体pPIC9K中,并将阳性克隆进行PCR、酶切和测序分析,构建pPIC9K-TIMP-1表达载体,电击转化到毕赤酵母,通过表型筛选和诱导表达得到蛋白表达工程菌,为进一步研究TIMP-1功能和作用机理等的研究创造了条件.     

家蝇防御素defensin cDNA的克隆及在毕赤酵母中的表达

提取家蝇总RNA,RT-PCR扩增编码家蝇防御素defensin的cDNA,克隆并测定了其序列,将该cDNA序列与酵母表达载体pPICZαA重组,构建酵母分泌型表达载体pPICZα-de,电激法转化毕赤酵母(Pichia pasto-ris)受体菌GS115。经表型筛选和PCR鉴定证明目的片段已稳定整合到酵母染色体基因组中。在含不同浓度的Zeoc in平板上筛选到高拷贝整合的转化子,阳性克隆经甲醇诱导表达,用Tric ine-SDS-PAGE确定了表达产物的正确性,琼脂孔穴平板扩散法、比浊法测定了表达产物的活性,对金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus具有一定的杀菌活性。     

巴斯德毕赤酵母高密度发酵表达rHCMVp的研究

目的：提高人巨细胞病毒嵌合肽(rHCMVp)在巴斯德毕赤酵母中的表达量,并进行发酵罐高密度发酵。方法：将生长培养基的菌体离心后等量接入诱导培养基中(包括不同体积分数的甲醇、pH值)培养,通过菌体密度检测和发酵液上清的SDS—PAGE结果分析不同条件、不同诱导时间对人巨细胞病毒嵌合肽表达的影响,并依据优化条件进行高密度发酵。结果：摇瓶培养时,转化子在体积分数1％的甲醇pH6．0的条件下诱导72h,A600(菌体密度)为45．2,目的蛋白表达量达到10．2mg／L。2L发酵罐进行了高密度发酵,经体积分数1％甲醇诱导48h,最终A600(菌体密度)达到124,每升发酵液中含目的蛋白57．21mg。结论：通过条件优化,进行高密度发酵,获得大量的rHCMVp。     

白藜芦醇合酶基因的克隆及对毕赤酵母的转化

目的建立白藜芦醇合酶基因的毕赤酵母表达系统。方法通过PCR、限制性内切酶消化、连接、电激等方法,构建表达载体,转化毕赤酵母GS115。结果从葡萄基因组DNA中扩增得到了 1 200 bp目的基因,并克隆至pBS-T栽体;成功构建了表达载体pPIC3．5K／RS;目的基因成功整合进毕赤酵母GS115基因组中。测序及PCR鉴定证明,白藜芦醇合酶基因的毕赤酵母表达系统建立成功。结论所得方法无需高质量的RNA,从而降低了试验条件,达到了快速简便的目的。     

黑曲霉外切葡聚糖酶基因密码子的优化及表达

通过NCBI(美国国立生物技术信息中心)对黑曲霉的来源外切葡聚糖酶基因(cbh1)的氨基酸序列进行分析,发现其16个活性部位中有6个位点附近的氨基酸为毕赤酵母(Pichia pasto-ris)表达的稀有密码子。利用反向长距离PCR技术将这些活性位点附近的稀有密码子定点突变为毕赤酵母表达偏爱密码子。将优化后的表达载体pPICZαA-cbh1m转入毕赤酵母KM71H菌株中进行诱导表达。经密码子优化后的cbh1m基因较未优化前cbh1基因的表达量提高了17%。