重组毕氏酵母发酵过程的结构模型

分析了毕氏酵母（Pichia pastoris)以甘油和甲醇为碳源时的代谢途径，建立了胞内物质流和能量流的平衡方程－结构模型。经过适当的降维，解得比碳源消耗速率，比氧消耗速率，比乙酰辅酶A生成速率，细胞比生长速率等关键反应速率。结合反应器模型获得操作变量与过程状态变量间的关系。用实验数据对模型进行了初步验证。结果表明，该模型能较准确地描述细胞生长和重组蛋白合成过程。     

Kex2p在甲醇酵母中的分泌表达

通过PCR方法得到去除C端201个氨基酸残基（胞浆区，跨膜区和Ser/Thr丰富区）的Kex2p的DNA片段，并将该片段装载到质粒pPICZ-C中构建成表达质粒pPICZ-C-KEX2ΔCP。经过大肠杆菌（DH5α）的扩增，表达质粒被转入甲醇酵母（GS115）中，并得以分泌表达。发酵上清液中存在切割肽链中双碱性氨基酸C端的酶活力，SDS－PAGE电泳的结果证实了Kex2p的分泌表达，以及Kex2p在溶液中的自降解。     

内皮细胞抑制素在毕节酵母中的表达与活性分析

采用PCR技术从人胎脑cDNA库中扩增了人内皮细胞抑制素基因。经DNA序列分析后将扩增的基因克隆至酵母载体pPICgK，获得的重组质粒pPIC9K-EDN转化毕节酵母GSll5，构建表达内皮细胞抑制素的酵母工程菌P.pastoris GSll5(pPIC9K-EDN)。SDS-PAGE分析结果显示：人内皮细胞抑制素在重组酵母GSll5(pPIC9K-EDN)中获得高效表达。用30L发酵罐构对建的工程菌进行高密度发酵，经甲醇诱导48h，生物量达到250OD，分泌量为150mg/L，发酵液经SP Streamline，SP Sepharose FF阳离子交换柱和SephamseHeparin Hi Trap柱纯化，产物纯度达到98％。纯化产物具有免疫活性并能抑制bFGF诱导的鸡胚绒毛尿囊膜血管生成。     

重组毕赤酵母表达reteplase发酵过程中的降解现象

研究了pH和温度对重组毕赤酵母表达retep lase(rPA)发酵过程中的降解现象。在低pH(4.5)诱导条件下,由于蛋白酶活性高,rPA降解严重,表达量几乎为0,提高诱导pH至6.5,蛋白酶活性降低,rPA的表达量最高达到122 m g/L。通过将诱导温度从30°C降低到20°C,rPA的表达量从153.2 m g/L提高到207.9 m g/L。降低温度能减少细胞死亡率,从而减少了发酵液中蛋白酶的释放,降低了蛋白酶的活性,抑制了对目的蛋白rPA的降解。另外,低温使胞内AOX酶活性提高,从而增强了rPA的表达。     

巴斯德毕赤酵母表达系统及其在医学领域的应用

毕赤酵母表达系统是近几年在外源蛋白表达方面应用比较广泛的一套工具,到目前为止,已用这个系统成功表达了200多种来自病毒、细菌、真菌、动植物和人的蛋白,如人白介素、人血清白蛋白、乙肝表面抗原、水蛭素等。本文就巴斯德酵母细胞的基本特性、宿主菌及其质粒、影响外源蛋白表达的因素和在医学上的应用作一综述。     

人白介素—12（P40）亚基在巴斯德毕赤酵母中的表达

运用PCR技术特异性地扩增了IL－12p40亚基cDNA的编码区序列,得到940bp的扩增片段,将其克隆于毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPICZαC的ClαⅠ,XbaⅠ位点,构建成重组表达质粒pPICZαC-p40。经LiCI2转化,Zeocin抗性筛选,得到含多拷贝p40基因的酵母工程菌Pichia pastoris X-33/p40,在φ=0.5%甲醇诱导下,p40基因得到了分泌型表达,培养上清的SDS－PAGE及Westem-blot均显示表达产物相对分子质量约44000,与预计大小相符,薄层凝胶扫描结果表明,分泌型表达占培养上清总蛋白量质量的47％。     

山蛭素（haemadin）在毕赤甲醇酵母中的表达及其性质鉴定

人工合成山蛭素基因后,利用基因重组的方法将山蛭素的基因克隆到pPicZαA载体,经过线性化,电转至毕赤酵母GS115中表达。使用浓度高达1500 μg/mL的zeocin筛选得到高拷贝插入的GS115-H菌株,经过优化摇瓶表达条件表达量达到100 mg/L。摇瓶培养物经离心取上清,分别使用3 kD和10 kD的超滤膜超滤,阳离子交换层析和凝胶过滤层析等纯化步骤之后,得到纯度高于95%的目的蛋白,产出量为40 mg/L,回收率为40%。通过以chromozym TH为底物的凝血酶酰胺水解实验证实了其体外生物学活性：其抑制凝血酶常数为(2.46±0.13)×10^-13 mol/L。     

毕赤酵母表达风味强化肽的分离与纯化

为了开发新型风味强化剂,采用硫酸铵分段盐析法、中空纤维超滤、阴离子交换树脂分离等方法,对构建的工程菌P.,postoris GS115-16B2发酵表达的16拷贝风味强化肽的分离纯化效果进行研究.实验结果表明,分离纯化最佳方法为:首先使用中空纤维进行超滤浓缩,经过两次稀释过滤浓缩后的浓缩液再采用离子交换树脂DEAE–52进一步分离纯化.经SDS-PAGE检测,纯化后16拷贝风味强化肽的平均纯度可达93.19%.     

菊黄东方鲀卵黄蛋白原肽段vWD的真核重组表达及功能研究

河鲀的卵黄蛋白原可能参与河豚毒素（TTX）的体内转运过程。为了探讨该机理,建立了毕赤酵母真核表达系统,成功地表达了菊黄东方鲀（Takifugu flavidus）卵黄蛋白原的vWD结构域肽段（rTF_vWD）,并采用Biacore-表面等离子体共振（SPR）系统检测了rTF_vWD与TTX的亲和力,以及腹腔注射小鼠验证rTF_vWD对TTX毒力的中和作用。结果表明:rTF_vWD与TTX的平衡解离常数（KD）为3.1 mmol/L;将TTX与rTF_vWD共孵后肌肉注射小鼠,2 h内小鼠的死亡率显著下降,表明TTX与rTF_vWD结合后,TTX的毒性降低了。     

毕赤酵母工程菌发酵生产重组Cu/Zn-SOD的工艺研究

系统考察毕赤酵母工程菌GS115表达重组铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)的发酵工艺参数,优化后5 L发酵罐上生产工艺为:采用BSM培养基,接种量5%(体积分数),发酵温度35℃,诱导期搅拌转速900r·min-1,pH值为6.0、维持溶氧(DO)水平为饱和值的20%以上.经过142 h发酵实验,SOD活力最高可达102.789 kU·mL~(-1),比优化前提高3.5倍.采用毕赤酵母工程菌能实现高效、大量制备优质动物来源的Cu/ZnSOD重组蛋白,具有良好的产业化潜力和广泛的应用前景.