牛肠激酶催化亚基cDNA的克隆及融合表达载体的构建

肠激酶(Enterokinase,EK)是目前生物制药领域纯化重组蛋白产品时用于切割融合蛋白的首选工具酶之一．为克隆表达牛肠激酶催化亚基(EKL)编码的基因,以期应用于融合蛋白的切割与纯化,从市售肉牛十二指肠组织中提取总RNA,以RT-PCR方法扩增其cDNA片段,将此片段克隆于pUCm-T载体中进行全序列分析．结果表明克隆的cDNA与GenBank上的序列相比完全一致．随后,将目的基因片段插入pET32a融合型表达载体中．经测序证实其重组DNA5’端多克隆位点与重组片段的接口处核苷酸顺序准确无误,所表达重组蛋白经SDS-PAGE分析,相对分子质量为50kD,表达量达38％,为进一步进行Enterokinase催化亚基蛋白表达及活性研究奠定了基础．     

含有嗜杀质粒的核融合缺陷突变株原生质体制备及再生条件的研究

利用由藤黄节杆菌(Arthrobacter latevs)分泌的,以β—1.3葡聚糖酶为主的酵母细胞壁溶解酶(Zymolyase),对含有嗜杀质粒的核融合缺陷突变株5045(α,his4,karl—1[KIL—K_1]rho~+)进行破壁,得到该菌株破壁,再生的最佳条件。为嗜杀酵母原生质体融合育种提供了依据。     

Efficient expression of human factor Ⅸ cDNA in liver mediated by hydrodynamics-based plasmid administration

Hydrodynamics-based administration via tail vein was used to deliver naked plasmid with human factor IX (hFIX) cDNA in 2.2 mL Ringer‘s solution into mice within 7 s. The peak level of expression of hFIX was 2921 ng/mL in mouse plasma. The hFIX cDNA expression increased with increasing the amount of plasmid DNA injected. The peak level of gene expression declined after repeated injection of plasmid (1459 ng/mL). The hFIX cDNA was detected in various organs, but the highest level of gene expression appeared in liver. Transaminase levels and liver histologicalresults showed that rapid intravenous plasmid injection into mice induced transient focal acute liver damage, which was rapidly repaired within 3--10 d. These results suggested that high-level expression of hFIX cDNA can be achieved by hydrodynamics-based plasmid transfer and this method is nowfurther used for gene therapy and gene function study in our lab.     

乙型肝炎表面抗原基因在酵母中的表达——Ⅰ.HBsAg基因在酵母中的克隆

将乙型肝炎表面抗原基因组装进穿梭质粒,经E.coli扩增、鉴定后转入酵母细胞得到了转化子。经放射免疫分析,在此转化子中HBsAg未得到表达,可能是阅读框架不一致造成的。此外,我们对酵母DNA重组技术进行了摸索,并简化和改进了一些步骤。     

反胶团法萃取质粒DNA

采用新的TOMAC(甲基三辛基氯化铵)/2-乙基己醇/异辛烷反胶团体系,对该反胶团萃取质粒pUT649进行了研究.考察了表面活性剂浓度、离子浓度等对质粒DNA萃取的影响.当采用1.0%(volume)2-乙基己醇/异辛烷为有机相,TOMAC浓度为40 mmol.L-1,水相初始DNA浓度为25μg.mL-1时,质粒pUT649的萃取率可达90%以上.离子浓度对萃取过程有重要影响,反萃取时通过调节水相中的离子浓度,可以实现DNA和RNA的分离.研究结果表明,TOMAC/2-乙基己醇/异辛烷反胶团体系适合于核酸的萃取和纯化.     

苯胺降解菌的特性研究及分子生物学基础

从长期受苯胺污染环境中筛选到一株细菌NKS．能以苯胺为唯一的碳源、氮源生长．NKS降解苯胺的最适温度和pH分别为30C和7.2，最适苯胺浓度为3000mg／L．NKS还可利用邻苯二酚和邻甲苯胺．提高接种浓度对NKS的降解效果有显著影响，重金属离子对NKS的生长和苯胺降解均有不同程度的抑制作用，以Ag^ ，Hg^ 最明显．对NKS与苯胺降解代谢有关酶类的测定结果表明，NKS中催化邻苯二酚开环的酶主要为邻苯二酚-2，3-双加氧酶(CD23O)．且该酶为诱导酶．PCR结果表明NKS中与苯胺酶降解有关酶的基因位于细菌的染色体上．     

蓝细菌新质粒载体pPRS－1的构建

以蓝细菌Ｐｌｅｃｔｃｎｅｍａｂｏｒｙａｎｕｍ内源小质粒ｐＰｂｓ（１．５ｋｂ）和Ｅ。ｃｏｌｉ质粒载体ｐＢＲ３２２（４．３ｋｂ）为材料，用限制性内切核酸酶ＣｌａⅠ分别消化，经Ｔ＿４ＤＮＡ连接酶连接，转化Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１感受态细胞，在含Ａｍｐ（Ａｐ）和含Ｔｅｔ（Ｔｃ）的ＬＢ琼脂培养基上筛选出Ａｍｐ￣ｒＴｅｔ￣ｓ的转化子，提取转化子的质粒，用ＣｌａⅠ消化，得１．５ｋｂ和４．３ｋｂ两片段，表明转化子所含质粒是ｐＰｂｓ和ｐＢＲ３２２的重组质粒，定名为ｐＰＲＳ－１。     

穿梭质粒pNBC11的构建及性质研究

质粒 pUB110与 pUC18分别册 EcoRI 酶切,T_4DNA 连接酶进行连接,得到重组质粒 pBC11。琼脂糖凝胶电泳分析,该质粒分子量为4.8×10~6道尔顿。pBC11是一种穿梭质粒,能转化大肠杆菌和枯草杆菌,它对大肠杆菌 C600、JM101的转化率分别为:4×10~5、1.5×10~5转化体/μgDNA.对枯草杆菌 BR151、QB1130的转化率分别为1.5×10~3、2.15×10~3转化体/μgDNA。在基因表达方面,pBC11上的 K_m~r 基因能在大肠杆菌和枯草杆菌中复制和表达,但 pBC11的 Ap~r 基因不能在枯草杆菌中表达。