胆固醇-7,8-脱氢酶大肠杆菌工程菌的构建

7-去氢胆固醇在化妆品和医药领域具有较大的应用需求,但现有的生产方法为化工法,流程复杂,且易污染环境.发酵法生产7-去氢胆固醇是一条新颖且具有潜在竞争力的生产途径.以虾Y-器官微粒体的cDNA文库为模板进行胆固醇-7,8-脱氢酶基因的扩增,与质粒载体连接后转化大肠杆菌,并对该工程菌的生物催化胆固醇-7,8-脱氢能力进行检测.     

波纹唇鱼神经肽Y基因的克隆及原核表达

以波纹唇鱼为实验对象,采用同源基因克隆技术和RACE技术得到神经肽Y基因的cDNA全长序列.波纹唇鱼npy的cDNA全长序列为645 bp,包含59 bp的5'UTR、300 bp的ORF和286 bp的3'UTR.分子进化的比对分析表明,波纹唇鱼NPY前体与斜带石斑鱼和锯隆头鱼的亲缘关系最近.波纹唇鱼ORF编码99个氨基酸,NPY前体多肽包括:信号肽、成熟肽、Gly-Lys-Arg翻译后加工位点和羧基末端侧翼肽段(CPON).该NPY前体的预测分子质量为11.27 kD,理论等电点为5.51.采用pET-32a(+)原核表达系统构建波纹唇鱼npy基因的原核表达重组子pET-32a(+)-NPY,并获得重组菌株.对重组蛋白表达菌株进行培养条件优化,结果表明:该菌株在30℃,0.6 mmol/L IPTG,培养时间8 h的条件下,重组蛋白的表达效率最高.     

AS-mCLB1重组质粒联合多西紫杉醇抗Lewis肺癌细胞增殖活性的研究

pAS-mCLB1转染Lewis肺癌(LL/2)细胞72 h后,再加用多西紫杉醇(40 nmol/L)处理细胞,MTT法测定药物对LL/2细胞的体外杀伤作用.另将LL/2细胞接种C57BL/6小鼠,成瘤后分别用pAS-mCLB1、多西紫杉醇和pAS-mCLB1+多西紫杉醇处理动物,3天1次,共4次,观察肿瘤体内增殖情况,流式细胞仪检测动物肿瘤组织的细胞凋亡.结果显示：pAS-mCLB1联合多西紫杉醇可明显降低LL/2细胞体内、外增殖活性,同时促使肿瘤组织中细胞凋亡增加,两种方法具有协同作用.pAS-mCLB1显著增强多西紫杉醇抗肿瘤效应,此增强作用可能与pAS-mCLB1诱导肿瘤细胞凋亡,提高了多西紫杉醇的细胞毒作用有关.     

SMART法构建蚕豆全植株cDNA文库

采用了一种简单而快速的全长cDNA文库构建法,即SMART法,并应用cDNA片段与质粒共转化大肠杆菌的方法,成功地构建了蚕豆全植株cDNA文库.     

蒙古绵羊β-防御素-1(SBD-1)cDNA的扩增与组织表达

为了获得蒙古绵羊β-防御素-1(SBD-1)的cDNA序列,从蒙古绵羊瘤胃的上皮组织中提取总RNA,采用反转录PCR(RT-PCR)技术扩增蒙古绵羊SBD-1的部分cDNA,结果扩增出cDNA 300个碱基.该cDNA包含由192个碱基组成的开放读码框(ORF),该ORF编码64个氨基酸的前原防御素.为了检测SBD-1mRNA在蒙古绵羊体内可能的表达器官,通过RT-PCR方法研究了SBD-1基因在蒙古绵羊各组织中的表达分布,结果显示,该基因在整个消化道(除直肠外)、气管、子宫、脾脏等管状器官内的黏膜层和脾脏内均有表达,而在所检测的实质性器官内,如心脏、肝脏、肺脏、肾脏、淋巴结、膀胱、卵巢等中没有表达.     

大黄鱼凝血酶原类似基因的克隆及其表达分析

采用快速末端cDNA扩增法,首次从大黄鱼中克隆到全长为2 023 bp的凝血酶原类似基因cDNA,编码为617个氨基酸,其中包括80 bp的5′末端非编码区及89 bp包含poly(A)尾的3′末端非编码区。预测1~15位的氨基酸处存在1个信号肽。推导的氨基酸序列与哺乳动物及其他鱼类进行同源性比较,发现其与红鳍东方鲀有73%同源性,而与哺乳动物的同源性为50%~65%。凝血酶原类似基因虽然在大黄鱼的各个组织中组成型表达,但是在减毒鳗弧菌免疫的大黄鱼的脾脏和肾脏中表达明显上调,这表明凝血酶可能参与大黄鱼对细菌侵染的免疫应答。     

分离与克隆中国人TPO基因片段及序列分析

应用ＲＴＰＣＲ技术从中国人胎肝细胞中分离出１个５６６ｂｐ大小的基因片段,经过克隆、限制性内切酶鉴定和序列分析证实为ＴＰＯ的ｃＤＮＡ片段．与ＧｅｎＢａｎｋ中发表的人ＴＰＯｍＲＮＡ的序列比较同源性在８２％～９９％之间,仅有２个碱基不相同,在１７５位密码子（５２３～５２５位的碱基）分别是ＣＧＧ和ＣＡＡ,即精氨酸（Ｒ）的位置上,中国人是谷胺酰氨（Ｇ）．而与测得的韩国人序列比较,在相应位置的氨基酸是相同的