锌指核酸酶介导的高效多位点基因打靶

该研究旨在建立锌指核酸酶介导的多位点基因打靶技术,为获得稳定遗传的转基因动物或基因治疗临床应用解决技术难题.首先利用OPEN平台设计、构建能识别人基因组内rDNA基因间隔序列的锌指蛋白基因序列,与FokⅠ的切割结构域连接、表达后获得锌指核酸酶基因,再构建锌指核酸酶真核表达载体.另外,构建含有2条同源重组引导序列和绿色荧光蛋白基因(EGFP)的多位点基因打靶载体.将锌指核酸酶真核表达载体和多位点基因打靶载体共转染HEK293细胞,内参对照PCR-灰度分析法检测外源基因定点整合效率,结果显示单独转染多位点基因打靶载体的定点整合效率为6.8%;而由于锌指核酸酶在染色质DNA上切割rDNA基因的间隔序列,诱导高效同源重组,锌指核酸酶载体、多位点基因打靶载体共转染的定点整合效率为24.2%,较常规基因打靶定点整合率(10-6～10-5)提高了24000多倍.共转染的HEK293细胞在无任何筛选的条件下持续培养2个月,经过20次传代之后,子代细胞能够持续表达EGFP,提示表达稳定.本研究建立了锌指核酸酶介导的高效多位点基因打靶技术,不仅大大提高了外源基因的定点整合效率,而且兼顾了基因表达的稳定性和安全性,为动物定点转基因和人类基因治疗提供了重要的技术平台,具有广泛的应用前景.     

枯草芽孢杆菌8-32拮抗菌株的紫外诱变选育

为了获得更高拮抗活性的菌株,以对大豆根腐病病原菌具有较强拮抗作用的Bacillus subtilis8-32为实验材料,采用紫外线诱变方法选育具有更高拮抗活性菌株.紫外诱变条件为30 W紫外线,15 cm辐射距离,诱变时间4 min.结果表明,经初筛和复筛,从诱变后菌落形态差异显著的100个菌株中,筛选得到3株(YB-1,YB-2和YB-3)拮抗活性明显增强的菌株,其拮抗活性与对照相比分别提高了50％,55％和50％,并且传代培养10次后其活性保持不变,说明诱变菌株YB-1,YB-2和YB-3遗传性状稳定.     

甘蓝型油菜EMS诱变材料的耐湿性鉴定与筛选

该研究以1 132份来自甘蓝型油菜中双9号和GH18的EMS诱变处理自交3代种子为材料,对芽期耐湿性进行综合评价.实验数据表明,EMS诱变后代的耐湿性存在广泛变异.以湿害处理的成苗率为指标进行初筛,有26％以上的材料成苗率高于50％.其中所选材料的5个耐湿性指标平均值均高于未诱变对照,各指标变异系数在0.106 6～0.485 3之间,变异丰富.用相对活力指数对其进行耐湿性分级,分别从GH18和中双9号的EMS诱变后代中筛选得到14个和2个强耐湿性材料,这16份材料可以作为甘蓝型油菜耐湿性育种的优异资源.     

重离子束辐射诱变技术在植物育种中的应用

重离子束辐射是一种新兴的辐射诱变技术,因其操作简单、突变率高、突变谱广等特点,已受到作物育种工作者的广泛关注。常用的重离子源有C、N、Ne等,不同植物物种、不同部位以及发育阶段对重离子束的敏感性不一。通过结合植物组织培养、基因工程等技术,国内外已对多种植物开展重离子束辐射育种的研究,获得一系列新种质和新品种。本文简要介绍重离子束辐射诱变的基本原理、相应的生物学效应以及在作物育种中的研究进展。     

应用定点突变技术进行流感病毒NS1蛋白功能的研究

目的流感病毒NS1基因敲除毒株(delNS1毒株)的获得可以使我们建立更有效的生物学关系,主要表现在流感病毒繁殖周期和致病的过程中,流感病毒NS1蛋白和双链RNA活性蛋白激酶(PKR)之间的生物学关系.资料表明,缺少功能性的PKR可以使delNS1毒株在其他非允许宿主中繁殖,这表明流感病毒NS1蛋白的主要功能是对抗或阻止PKR调解抗病毒效应.因此,本实验为了证明流感病毒NS1蛋白对其复制和毒力的影响.方法应用定点突变技术进行流感病毒NS1基因的第38位和第41位氨基酸残基位点的定点突变;然后进行细胞转染包装成新的缺陷病毒;再对其进行转染后产量的测定,如TCID50和PFU.结果包装成的缺陷病毒与包装成的非缺陷病毒相比,缺陷病毒的TCID50和PFU明显下降.结论本实验证明了流感病毒NS1蛋白在流感病毒复制过程中,使其产量和毒力下降.     

Structure and function of eukaryotic NAD(P)H:nitrate reductase

Pyridine nucleotide-dependent nitrate reductases (NRs; EC 1.6.6.1–3) are molybdenum-containing enzymes found in eukaryotic organisms which assimilate nitrate. NR is a homodimer with an ∼100 kDa polypeptide which folds into stable domains housing each of the enzyme's redox cofactors—FAD, heme-Fe molybdopterin (Mo-MPT) and the electron donor NAD(P)H—and there is also a domain for the dimer interface. NR has two active sites: the nitrate-reducing Mo-containing active site and the pyridine nucleotide active site formed between the FAD and NAD(P)H domains. The major barriers to defining the mechanism of catalysis for NR are obtaining the detailed three-dimensional structures for oxidized and reduced enzyme and more in-depth analysis of electron transfer rates in holo-NR. Recombinant expression of holo-NR and its fragments, including site-directed mutagenesis of key acative site and domain interface residues, are expected to make large contributions to this effort to understand the catalytic mechanism of NR.     

果蝇醇脱氢酶S—139定点突变后活性的变化

经酶动力学分析，丝氨酸－１３９的突变体Ｓ１３９Ａ使ＤｍＡＤＨ完全失去催化活性。Ｓ１３９Ｃ和Ｓ１３９Ｔ使ＤｍＡＤＨ的催化能力分别下降为野生型的１４．３％和４１．６％以及４７％和７６％，而且Ｋｃａｔ／Ｋｍ（Ａｌｃ）和ＣＡＴ（Ｋｍ（ＮＡＤ）差异极为显著；对于乙醇，突变体相对于野生型变化不大；而对于ＮＡＤ，突变体相对于野生型下降到原来的１０％以上。     

紫外诱变球孢白僵菌选育几丁质酶高产菌株方法的研究

本实验利用紫外线对白僵菌进行诱变，比较了不同诱变剂量对白僵菌产几丁质酶的影响，从而筛选出几丁质酶高产菌株．     

水稻白叶枯病菌1个毒性相关基因的鉴定

我们曾报道了来自水稻白叶枯病菌真基文库的重级质粒ｐＧＸＮ３０００中含有一个能互补甘蓝黑腐病菌ｒｐｆＧ致病因子调控基因突变全的基因，并通过转座子诱变获得子转座子插在ｐＧＸＮ３０００中的这一基因的转座子插重组质粒，本研究利用这些转座子插入重组质粒，通过标记置换方法构建了不稻白叶枯病菌这一基因的突变菌株，植株试验结果表明，突变株虽然在水稻中仍能正常生长繁殖，但毒性严重降低，说明水稻白叶枯病菌的这一基因在     

电磁辐照诱发家蚕变异的实验研究

电磁场辐照家蚕卵,能使家蚕产生明显的变异.比较试验的研究结果显示,经过电场刺激后的蚕种,茧质和茧量均有所提高;此外,也观察到生物大分子的局部结构变化的表现型变异.