宫颈癌中CALCA基因甲基化与HPV16-E7致癌蛋白表达的依存关系

 选择HPV16 阳性宫颈癌细胞和RNAi 技术,研究CALCA 基因甲基化与HPV16-E7 致癌蛋白表达的依存关系。构建慢病毒siRNA 重组表达载体,建立稳定表达HPV16-E7-siRNA 的RNAi 细胞模型。以SiHa 细胞和RNAi 细胞模型的基因组DNA 为对象,选择CALCA 基因启动子区富含CpG 岛屿的目标片段,使用亚硫酸氢盐测序法（bisulfite sequencing PCR,BSP）筛查分析,研究RNAi 抑制HPV16-E 7 表达后,CALCA 基因甲基化状态的可逆性程度。选出CALCA 基因启动子区富含CpG 位点的目标片段,其大小为365 bp,含有19 个CpG 岛屿,发现其中13 个CpG 位点的胞嘧啶在SiHa 细胞基因组DNA 中发生了甲基化（13/19）,而在表达HPV16-E7-siRNA 的RNAi 细胞模型中,所有CpG 位点的甲基化已发生逆转（0/19 位点）。本研究从细胞水平证明了宫颈癌细胞内的CALCA 基因启动子高甲基化对HPV16-E7 致癌蛋白表达有依赖性,为进一步研究E7 蛋白的作用及致癌机制奠定了重要的物质基础。     

枝状枝孢霉MD2的Unigene A03231的克隆及原核表达分析

为研究真菌紫杉醇合成相关基因的功能,从产紫杉醇真菌枝状枝孢霉MD2中克隆了Unigene A03231的DNA和c DNA全长序列(918 bp).结果表明:该基因不含内含子,其编码产物含305个氨基酸,与短链脱氢酶/还原酶一致性为64%,预测蛋白分子量为33071.5 Da,不存在信号肽,含有2个跨膜结构.Unigene A03231以单拷贝形式存在于基因组,在0~30 h内其表达水平随茉莉酸甲酯诱导表现为先升高后降低.构建了该基因的原核表达菌株,初步优化了其在大肠杆菌BL21中的诱导表达条件为:诱导温度28℃,IPTG浓度0.6 mmol/L,诱导时间8 h.为深入分析该基因的催化功能奠定了基础.     

紫藤种子总RNA提取方法研究

分离提取高质量的RNA是基因表达、调控和基因工程等研究的基础。植物组织中含有大量RNA酶、多糖和酚类等杂质,影响了高质量总RNA的获得。应用改良的CTAB法提取紫藤种子中的总RNA,添加了PVP、β-巯基乙醇和水饱和酚氯仿后能有效地除去大部分杂质,获得高质量的紫藤种子总RNA。3'RACE实验结果表明,以此总RNA反转录获得的cDNA为模板,可成功扩增紫藤种子中的防御素基因。     

甘薯HXK基因的克隆、组织表达及生物信息分析

通过RT-PCR技术从甘薯的总RNA中克隆得到了全长的己糖激酶基因,测序结果表明HXK(hexokinase)基因编码区长1491bp,编码496个氨基酸,其翻译的蛋白质分子量为53.4kD,其氨基酸序列与其它已知高等植物HXK基因具有很高的同源性.构建了原核表达载体pET-HXK,经IPTG诱导后可表达获得相对分子量约为71kD的外源融合蛋白,与预测结果一致.并对HXK基因在不同组织中的转录水平进行了数字表达谱和荧光定量分析.     

利用CRISPR/Cas9技术创制水稻Waxy基因等位突变体

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,在粳稻品种“嘉花1号”的颗粒结合型淀粉合成酶Ⅰ基因（Waxy,Wx）的启动子区域、5''UTR区域,以及第2、3外显子区域设计基因敲除靶点,获得4种不同类型的纯合编辑水稻突变体,随后对其进行稻米品质与农艺性状分析. 结果表明：不同类型Wx纯合编辑突变体与野生型“嘉花1号”相比,核心启动子区域编辑的突变体wxpro直链淀粉含量（AC）下降至14.09%;5''UTR区域编辑的突变体wxutr的AC下降至11.76%,且淀粉粒排列松散;而在外显子区域编辑的突变体wxex2和wxex3的AC下降至2%以下, 与糯稻品种类似. 本研究创制了能稳定遗传且AC不同的纯合突变株系,不仅使水稻Wx基因的等位突变类型变得更加丰富,也为水稻食味品质改良提供了优良的遗传育种材料.     

特应性皮炎与过敏进程

基于巴斯德毕赤酵母表达系统探讨了屋尘螨过敏原Der p 1的重组表达与纯化。首先,采用毕赤酵母GS115表达密码子优化的全长编码基因PreProDer p 1,其产量可达100 mg/L,进一步共表达分子伴侣实现产量提高到140 mg/L,并实现3 L反应器发酵产量提高到1 g/L。其次,对上述重组蛋白发酵液分别使用阳离子交换层析及亲和层析进行了纯化工艺优化,目的蛋白得率达到60.7%。本研究为后续PreProDre p 1诊断试剂盆的开发提供了参考。

     

杜鹃AQP基因家族的鉴定与生物信息学分析

为了研究杜鹃水通道蛋白基因家族的生物学功能,本研究利用生物信息学方法在杜鹃基因组中鉴定了35个水通道蛋白基因。基因位置分析水通道蛋白基因在杜鹃13条染色体上不均匀分布。聚类分析显示杜鹃水通道蛋白可以分为5个亚家族（PIP、TIP、NIP、SIP和XIP）。启动子响应元件分析发现大部分AQP基因启动子区所含元件与激素调节、光响应和抗逆胁迫等密切相关。共线性分析表明有4对AQP基因出现了片段重复;Ka/Ks（同义替换/非同义替换）结果显示均小于1,表明这些基因经历了较强的纯化选择。本研究为了解杜鹃水通道蛋白家族的功能提供了理论基础。     

Pollen carryover and neighbourhood inRanunculus bulbosus

The pattern of gene flow has a major influence on the spatial scale of evolutionary processes. In plant populations pollen carryover will influence the pattern of gene flow. InRanunculus bulbosus L. pollen carryover was found to occur over a maximum of 5 flowers, with seed set per flower decreasing in a curvilinear fashion with increasing visit number in a sequence of visits by a bee after pollen pick-up from a donor plant. The effect of pollen carryover is to increase both neighbourhood area and neighbourhood size by two-fold.     

Hybridization histochemistry

Summary The location of gene expression by hybridization histochemistry is being applied in many areas of research and diagnosis. The aim of this technique is to detect specific mRNA in cells and tissues by hybridization with a complementary DNA or RNA probe. Requirements for optimal specificity, sensitivity, resolution and speed of detection may not all be encompassed in one simple technique suitable for all applications, thus appropriate procedures should be selected for specific objectives. With reference to published procedures and our own extensive experience, we have evaluated fixatives, probes, labels and other aspects of the technique critical to the preservation and hybridization in situ of mRNA and detection and quantition of hybrids.