慢病毒载体及其介导的RNA干扰在基因治疗中的应用研究

主要就慢病毒载体及其介导的RNA干扰技术在基因治疗中的应用研究进行了综述,并对其在该领域具有的广阔前景进行了展望.慢病毒载体作为一种新型的载体,可有效地将携带的目的基因导入宿主细胞,并将其整合到宿主细胞基因组中,从而使目的基因得以持久稳定地表达.该载体因具有高感染性、高表达效率及不易诱发宿主免疫反应等优点,已成为基因治疗研究中的一个重要工具.RNA干扰技术可以特异性抑制或关闭特定基因的表达,因此该技术可广泛应用在基因功能探究和恶性肿瘤治疗等领域.由慢病毒载体介导的RNA干扰技术能持久、稳定、特异性地抑制各类细胞中特定基因的表达,在病毒感染、肿瘤等疾病的基因治疗中被广泛应用,成为生物医学领域的新热点.     

含FMDV中和表位的重组病毒颗粒的构建及鉴定

针对FMDV的疫苗研究一直是防控口蹄疫的重点,而病毒样颗粒(VLPs)形式的疫苗因其安全性和近似传统灭活疫苗的良好免疫效果,近年来逐渐成为疫苗研究的一个新方向.本实验利用猪圆环病毒PCV2的衣壳蛋白(CAP)作为载体,分别插入FMDV MYA98毒株的抗原表位组合——VP1蛋白上B细胞表位141~160aa(B)与串联的B细胞和T细胞表位141~160aa-21~40aa-141~160aa(BTB),构建对应重组杆状病毒,分别命名为reBAC-CAP-B,reBAC-CAP-BTB.将上述病毒颗粒转入Sf9细胞表达,收获重组杆状病毒并再次感染Sf9细胞扩大病毒滴度,获得目的蛋白CAP-B,CAP-BTB,经过SDS-PAGE,Western blot鉴定正确,透射电镜观察到20~30nm大小的目的颗粒.     

乳腺癌Jab1蛋白调控Nov基因的表达受甲基化水平影响

为探讨癌基因Jab1在乳腺癌发生发展中的功能,首先在乳腺癌细胞MDA231中建立了慢病毒介导的Jab1基因的表达干扰系统,并通过人基因表达谱芯片分析结果以及实时定量PCR实验筛选出受Jab1调控的下游基因;此外,通过实时定量PCR以及Western blot实验证实Jab1干扰表达能降低Nov基因在转录和翻译水平表达,而且Nov启动子区域存在4个高甲基化CpG位点.进一步使用甲基转移酶抑制剂处理Jab1干扰表达细胞,发现与未使用抑制剂处理细胞相比,Nov基因的mRNA和蛋白质表达水平发生明显上调,说明Jab1基因调控Nov表达受甲基化水平的影响,提示Jab1可能是通过表观遗传学水平调控Nov基因的表达.     

非小细胞肺癌细胞A549对紫杉醇耐药机理研究

目的利用非小细胞肺癌细胞对紫杉醇的耐药株A549/taxol,研究其对紫杉醇耐药性的分子机理.方法通过长时间低浓度的紫杉醇处理A549细胞的方法获得其耐药细胞株A549/taxol,提取细胞总RNA并逆转录为cDNA,实时荧光定量PCR观察其凋亡基因的表达情况,并通过不同siRNA处理细胞进行基因沉默,研究其在不同遗传背景下对紫杉醇的耐受情况.结果发现非小细胞肺癌细胞对紫杉醇的耐药株A549/taxol的基因表达紊乱,表现为ING5的高表达抑制了凋亡基因Bcl-2的表达水平,而Bcl-2是紫杉醇诱导细胞凋亡所必需的.结论以上结果初探了A549对紫杉醇耐药性的机制,为探寻紫杉醇化疗新策略提供了新的思路.     

检测AKT1基因E17K突变的高分辨率熔解曲线法（HRM）的建立及应用

建立并优化HRM方法检测AKT1基因的E17K(49G>A)突变,并在85例非小细胞肺癌中应用该法检测AKT1基因的E17K突变.设计、合成针对AKT1基因的E17K突变的引物、探针,优化不对称PCR条件及高分辨率熔解曲线(HRM)基因突变分析方法.对85例非小细胞肺癌标本提取的基因组DNA,应用HRM基因突变分析方法和直接测序的方法检测了AKT1基因的E17K突变情况.经优化后,设计的引物在不对称PCR反应条件下可扩增出良好的条带.检测探针与野生型模板的扩增产物杂交后,其解链温度要高于与突变型产物杂交的解链温度.野生型和突变型的质粒模板所产生的熔解曲线可见显著差异,相应的Tm值相差约 3.5℃.经HRM基因突变分析方法和直接测序法检测,在85例非小细胞肺癌标本检测到1例AKT1基因的E17K位点为杂合突变型,其余均为野生型.本研究建立的对AKT1 E47K突变检测的HRM方法是一种灵敏、准确、快速的方法.另外,本研究仅在非小细胞肺癌患者中发现频率极低的AKT1 E47K突变.     

儿童脑囊虫病脑CT检查与脑脊液中循环抗原和抗体检测的比较研究

采用脑CT检查、循环抗原及抗体检测方法,对408例儿童脑囊虫病患者进行了对比研究。结果表明,采用这三种检测方法,所得结果一致。说明三种方法都是诊断脑囊虫病的好方法,综合运用三种方法。可提高诊断率和确诊率。     

CE与EP方案治疗小细胞肺癌的临床疗效评价

为观察CE与EP方案治疗小细胞肺癌的近期疗效和毒副反应,对52例小细胞肺癌患者按住院先后顺序,随机分为CE组(卡铂+足叶乙甙)和EP组(顺铂+足叶乙甙),化疗2周期后评价疗效。结果近期疗效方面,CE组CR6例,PR14例,总有效20例(76.9%);EP组CR5例,PR13例,总有效18例(69.2%),两组比较无差别(P>0.05)。在毒副反应方面,CE与EP两组发生Ⅱ度以上的胃肠道反应及骨髓抑制无差别,患者均能耐受。说明CE与EP方案治疗小细胞肺癌均有效,且近期疗效无差别,毒副反应均能耐受,均可作为小细胞肺癌一线化疗方案。     

RNA干扰在肿瘤转移研究中的应用

RNA干扰是与特定基因同源互补的双链RNA在体内以序列特异的方式引发靶基因的mRNA降解,从而导致转录后基因沉默的过程。由于其在基因沉默中的高度特异性和有效性,在基因功能和基因药物的研究中有很大潜力。综述了RNA干扰可能的分子机制、分子生物特性和其在肿瘤特别是肿瘤转移中的应用。     

ROC曲线评价酶免法检测消化病患者幽门螺杆菌

摘要 目的 探讨消化疾病患者粪便幽门螺杆菌特异性抗原（Hp Stool antigen ,HpSA）在诊断Hp感染中的临床意义。方法 随机收集353例北京军区总医院消化内科住院和门诊患者,其中男性206例,女性147例,年龄范围14 - 89岁,平均年龄49.0? 15.73岁。入组者均空腹6小时以上,留取新鲜粪便标本,应用酶免疫法（EIA）检测HpSA,同时以13C-尿素呼气试验（13C-UBT）作为金标准。应用SPSS15.0软件对数据进行统计学分析,并绘制受试者操作特征分析曲线（Receiver Operating Characteristic curve, ROC curve）,评价HpSA试验的诊断价值。 结果 X 2 检验表明EIA法检测Hp感染与13C-UBT比较差异无显著性（p >0.05）; EIA法检测HpSA敏感度94.35%,特异度98.30%,阳性预测值98.24%,阴性预测值94.54%,阳性似然比55.5,阴性似然比0.06,符合率96.32%,Youden指数0.93,Kappa值0.93;EIA法检测HpSA的ROC曲线下面积为0.944,与完全无诊断价值的机会线下面积0.50相比差异显著（p<0.001）。结论 HpSA是一种非侵入性诊断Hp感染的方法,准确性和可靠性均较高,值得推广应用。