低温菌穿梭质粒的构建及转化方法研究

 由于低温微生物在细胞结构上的特殊性,使得对它们进行遗传操作受到很大的限制.以分离自冻土的低温菌Acinetobacter sp.DWC6为宿主菌,构建了一套外源DNA导入系统.通过在质粒pBR322和pUC118中插入一段Acinetobacter属特异性的Ori片段,成功构建了一系列穿梭质粒,并建立了稳定的转化方法,所有重组质粒均可在Escherichia coli和Acinetobacter sp.DWC6中正常复制.通过优化转化方法,使质粒在低温菌Acinetobacter sp.DWC6中的转化率达3×10⁶转化子/μg DNA.     

CaCl2浓度对感受态细胞转化效率的影响

对于E.coli菌株用8种不同浓度的CaC l2制备感受态细胞,然后转化各浓度的感受态细胞。实验结果表明,不同浓度CaC l2溶液处理所得到的感受态细胞,其转化效率有很大的不同。随着CaC l2浓度增高,转化效率也随之提高,在80m mol/L~100m mol/L时达到峰值,进一步提高CaC l2的浓度,转化效率急剧下降。还探讨了-70℃贮存时间对转化效率的影响。     

弹性蛋白酶保护因子--Elafin结构基因腺病毒载体穿梭质粒的构建、鉴定及表达

构建能表达弹性蛋白酶保护因子———elafin基因腺病毒表达载体的穿梭质粒,为进一步包装能高效表达结构蛋白的腺病毒载体做准备.以含有elafin基因的真核质粒pEGFP-N1-Elafin为模板,PCR扩增elafin基因,PCR产物以SalⅠ、EcoRⅤ双酶切,定向插入到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中CMV启动子下游SalⅠ与EcoRⅤ位点之间,获得重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-Elafin,通过SalⅠ及EcoRⅤ双酶切、PCR及插入片段序列测定对该质粒进行鉴定,将pAdTrack-CMV-Elafin转染293细胞,以RT-PCR及Western-Blot检测其在293细胞中的瞬时表达.结果表明:双酶切、PCR及测序鉴定证实,pAdTrack-CMV-Elafin穿梭质粒的插入片段为elafin基因,用pAdTrack-CMV-Elafin穿梭质粒转染293细胞后可见绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR和Western-blotting表明其可在293细胞中瞬时表达.     

人源化IGF-Ⅰ基因的人工合成、重组与表达

为了实现人源化胰岛素样生长因子Ⅰ(human insulin-like growth factors-Ⅰ,hIGF-Ⅰ)基因在大肠杆菌中的高效表达,了解IGF-Ⅰ基因结构与功能的关系,探索人工制备的hIGF-Ⅰ在临床治疗疾病上的应用,实验参照GenBank中人IGF-Ⅰ氨基酸序列并进行密码子优化,然后人工合成这条基因并将克隆至pUC57载体上.构建重组表达载体pGEX-6P-1-hIGF-Ⅰ,转化大肠杆菌BL21菌株,进行不同诱导条件的优化,SDS-PAGE电泳确定最佳诱导条件,并利用建立hIGF-Ⅰ的间接ELISA检测方法分析表达产物活性.结果表明,获得重组表达载体pGEX-6P-1-hIGF-Ⅰ,并在大肠杆菌中实现与GST蛋白的融合可溶性表达.最佳诱导条件OD600值为0.8、IPTG浓度为0.5 mmol/L,表达蛋白的浓度为2.811 mg/mL,且产物具有抗原活性.说明人工制备的hIGF-Ⅰ与天然的hIGF-Ⅰ生物活性有部分相同,在基础研究和药物开发方面可作为替代物进行研究.     

氨基化的介孔二氧化硅纳米材料与pDNA作用

采用共沉淀法合成高度有序、分散性良好的氨基化介孔二氧化硅纳米材料(Am-MSNs),并研究其吸附和保护质粒DNA(pDNA,PEGFP-N3)的性质,测定样品材料对A549和HeLa细胞的生物相容性.实验结果表明:Am-MSNs能有效吸附PEGFP-N3,并保护PEGFP-N3免受限制性内切酶的消化;Am-MSNs对A549和HeLa细胞表现出较高的生物相容性,当材料的质量浓度为125μg/mL时,两种细胞的存活率均约为100%.     

人tPA基因真核表达质粒载体构建及其生物学功能研究

构建携带组织纤溶酶原激活物(tPA)基因真核表达质粒pcDNA3.1( )/tPA,并研究其有无生物学活性.用RT-PCR法从人心脏组织中克隆tPA基因并将其克隆至真核表达质粒pcDNA3.1( )中,对pcDNA3.1( )/tPA进行酶切鉴定和测序.脂质体介导pcDNA3.1( )/tPA转染血管平滑肌细胞,分别用Nothern Blot和斑点印迹法从mRNA和蛋白质水平检测tPA的表达,并用纤维蛋白板法测定表达产物的生物学活性.成功克隆了人tPA基因并构建了pcDNA3.1( )/tPA真核表达质粒,pcDNA3.1( )/tPA转染VSMC后,tPA mRNA和蛋白质表达增加,所表达的tPA蛋白质具有纤溶活性.     

辐射致DNA损伤中DNA浓度的影响

利用重离子⁷Li和γ射线在同一剂量和不同浓度下对质粒DNA的水溶液和添加了甘露醇的溶液进行了辐照. 凝胶电泳结果表明, 随着DNA浓度的降低, 经重离子⁷Li和γ射线辐照后, DNA损伤越来越严重. 当添加了自由基清除剂甘露醇后, 重离子⁷Li和γ射线辐照后的结果出现了很大的不同. γ射线辐照DNA后, DNA损伤很轻, 只有开环形态出现轻微变化. 重离子辐射后的结果表明在自由基被大部分清除的条件下, 线性DNA依然存在且随着DNA浓度的降低而增加, 进一步证明了在重离子辐照致DNA双链断裂中由于直接作用而诱发的DSB(double-strand break)是不能被清除的. 对实验数据的计算与分析表明, 当DNA浓度低于一定值(比如50 ng/μL)后, 重离子辐照过程中自由基的间接作用与电离的直接作用所造成的平均双链断裂损伤的比例是一定的, 与DNA的浓度没有关系. 随着浓度的增加, 重离子辐照的直接作用在辐照损伤过程中所占的比重增加. 还讨论了DNA浓度在重离子⁷Li和γ射线辐照过程中对DNA损伤影响的可能成因, 诸如重离子的径迹结构、反应几率和DNA构象变化等.     

酵母质粒的快速提取法

早期制备酵母2μm质粒的方法多是采用机械破碎细胞,所得到的质粒DNA中含染色体DNA碎片较多,得率也不高。Cameron和Devenish采取碱裂解法要求严格控制溶液pH值在12.45,因之不易操作,使此法运用受到限制。近年来,有人采用先提取酵母总DNA,再以酸酚法抽提质粒,仍然要求严格地保持提取液的pH值。用微量快速提     

结核分枝杆菌Ag85B基因克隆及真核表达质粒pIRES-Ag85B的构建

目的:克隆并构建编码结核分枝杆菌Ag85B分泌蛋白的重组真核表达质粒,为进一步研究其在开发新型的结核病疫苗和结核病免疫诊断试剂奠定了基础。方法:采聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Ag85B基因,然后用双内切酶消化PCR产物和pIRES质粒,用T4 DNA连接酶连接后,转化入感受态E.coli DH5a,产物铺AmpR抗性的平板,阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定并进入blast网页比对测序的序列。结果:酶切鉴定所切下的片段大小与预计相符,测序比对后结果与目的基因完全一致,证实符合表达框架。结论:成功地克隆并构建Ag85B基因的真核重组表达质粒pIRES-Ag85B。     

硅藻DNA片段在表达质粒pMZR中再克隆的研究

用部分酶切法切开表达质粒 pMZR 中一个 HindⅢ位点后,插入了一个带 HindⅢ粘性末端的1kb 硅藻 DNA 片段重组 DNA 分子转化 E.coli LE392,对转化子中的重组 DNA 分子用酶切分析后,鉴定了1kb DNA 片段插入 pMZR 的位置。