天冬氨酸酶基因工程菌质粒pXZ70的稳定性

将pSC101质粒上的Par区域（控制质粒分配的基因座）克隆到含有天冬氨酸酶基因的质粒pXZ70上，构建成重组质粒pZZ1，将pZZ1质粒转化入大肠杆菌JM109细胞中，得到一株质粒可稳定遗传的重组子细胞，培养100代后，含质粒菌数仍在90％以上．     

枯草芽孢杆菌质粒pGB38复制子的分离及其稳定…

质粒ｐＧＢ３８是从中国戈壁滩沙土的枯草芽孢杆菌中分离得到的天然质粒。该质粒基因组总长为５．８ｋｂ，相对于细胞染色体的考贝数是４个，最小复制子们于１．５ｋｂ的ＨｉｎｄＩＩＩＤＮＡ片段，在没有任何选择压的条件下能够稳定持久地存在于细胞内，显然有着优良的质粒特性，利用质粒ｐＧＢ３８的复制子构建了穿梭质粒ｐＧＢ２０和ｐＧＢ１５，重组穿梭质粒的分离稳定性好，可以作为理想的枯草芽杆菌的基因工程载体。     

质粒PBR322—脂质体的制备及其内含DNA的转移

采用改进的逆相蒸发法（ＲＥＶ）制备卵磷脂／胆固醇（７：３，ｍｏｌ／ｍｏｌ）脂质体，并用于包裹荧光特异标记的质粒ＰＢＲ３２２ＤＮＡ，构建了基因转移载体。然后将纯化的质粒ＰＢＲ３２２ＤＮＡ－脂质体与悬浮的白菜原生质体一起温育。经过ＤＮＡ－ＤＡＰＩ荧光复合物的镜检，证明ＤＮＡ被包裹到卵磷脂／胆固醇脂质体内。被包装的ＤＮＡ能有效地避免外源ＤＮＡａｓｃ的降解作用。且质粒ＤＮＡ通过脂质体与原生质体膜的融合可随     

低温菌穿梭质粒的构建及转化方法研究

 由于低温微生物在细胞结构上的特殊性,使得对它们进行遗传操作受到很大的限制.以分离自冻土的低温菌Acinetobacter sp.DWC6为宿主菌,构建了一套外源DNA导入系统.通过在质粒pBR322和pUC118中插入一段Acinetobacter属特异性的Ori片段,成功构建了一系列穿梭质粒,并建立了稳定的转化方法,所有重组质粒均可在Escherichia coli和Acinetobacter sp.DWC6中正常复制.通过优化转化方法,使质粒在低温菌Acinetobacter sp.DWC6中的转化率达3×10⁶转化子/μg DNA.     

CaCl2浓度对感受态细胞转化效率的影响

对于E.coli菌株用8种不同浓度的CaC l2制备感受态细胞,然后转化各浓度的感受态细胞。实验结果表明,不同浓度CaC l2溶液处理所得到的感受态细胞,其转化效率有很大的不同。随着CaC l2浓度增高,转化效率也随之提高,在80m mol/L~100m mol/L时达到峰值,进一步提高CaC l2的浓度,转化效率急剧下降。还探讨了-70℃贮存时间对转化效率的影响。     

弹性蛋白酶保护因子--Elafin结构基因腺病毒载体穿梭质粒的构建、鉴定及表达

构建能表达弹性蛋白酶保护因子———elafin基因腺病毒表达载体的穿梭质粒,为进一步包装能高效表达结构蛋白的腺病毒载体做准备.以含有elafin基因的真核质粒pEGFP-N1-Elafin为模板,PCR扩增elafin基因,PCR产物以SalⅠ、EcoRⅤ双酶切,定向插入到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中CMV启动子下游SalⅠ与EcoRⅤ位点之间,获得重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-Elafin,通过SalⅠ及EcoRⅤ双酶切、PCR及插入片段序列测定对该质粒进行鉴定,将pAdTrack-CMV-Elafin转染293细胞,以RT-PCR及Western-Blot检测其在293细胞中的瞬时表达.结果表明:双酶切、PCR及测序鉴定证实,pAdTrack-CMV-Elafin穿梭质粒的插入片段为elafin基因,用pAdTrack-CMV-Elafin穿梭质粒转染293细胞后可见绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR和Western-blotting表明其可在293细胞中瞬时表达.     

国内期刊亮点

正乙酸钙不动杆菌磷脂酶C在大肠杆菌中重组表达、纯化及酶学性质江南大学汪艳红等以A.calcoaceticus ATCC17902基因组DNA为模板,PCR扩增得到2段磷脂酶C基因(PLC1、PLC2),构建重组大肠杆菌表达质粒并转化大肠杆菌BL21(DE3)中,实现PLC1、PLC2基因的表达。IPTG诱导表达后,经镍柱亲和层析纯化重组蛋白。成功构建2株产磷脂酶C的重组大肠杆菌并纯化,样品经SDS-PAGE分析在80 k Da附近均出现显著的特异性条带。得到了酶的活性、最适温度、最适p H的等酶     

猪β干扰素基因17位丝氨酸突变体重组酵母表达载体的构建

根据猪β干扰素基因序列设计一对引物,并按酵母密码子的偏好性,在引物中对稀有密码子进行同义突变,即第3位的TAT基因突变为TAC,第7位的CGA基因突变为AGA,第164位的CGG基因突变为CGT。同时,利用聚合酶链式反应基因定点突变技术,把17位的半胱氨酸密码子TGT突变为丝氨酸密码子TCT,构建poIFNβSer17...     

球孢白僵菌海藻糖-6-磷酸合成酶基因tps1真核表达载体的构建

本研究针对球孢白僵菌的tps1基因,通过双酶切和T4连接,构建了tps1基因的真核表达载体pPIC9K/tps1.PCR鉴定和测序表明,该重组质粒包含了球孢白僵菌tps1基因的全长cDNA序列.并且Bbtps1基因被正确地插入到了pPIC9K质粒的表达框中.因此,该重组质粒可以直接用于tps1基因的酵母表达.