一株来源于深海热液区嗜热细菌的分离及鉴定

从西南印度洋热液区沉积物样品中分离纯化获得一株中度嗜热产芽孢杆菌,命名为M6.菌株M6为革兰氏阳性菌,短杆状,可成对.菌株M6的生长温度为35～65 ℃(最适生长温度60 ℃),生长pH为6.5～8.5(最适生长pH为7.0～8.0),生长NaCl质量分数为0～4%(最适NaCl质量分数为2%),生长盐度为0～80人工海水(最适盐度为40).16S rRNA基因相似性分析表明,菌株M6属于不产氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus),与Anoxybacillus rupiensis菌株同源性最高,达99%;但16S～23S rDNA 间隔区PCR扩增分析表明,该菌与同属菌株有较大差异.通过以上形态学、生理特征以及分子生物学鉴定,认为菌株M6为不产氧芽孢杆菌属的菌株.另外,菌株M6可分泌胞外高温淀粉酶.菌株M6胞内含有内生质粒,其大小约为10 kb,命名为pAB01.     

邻氯硝基苯降解菌OCNB-1的分离鉴定与降解质粒

以邻氯硝基苯为唯一碳源、氮源和能源,从某化工厂废水处理站活性污泥中分离出一株细菌OCNB-1, 经微生物自动测定仪WSVTK-R07.02和16S rDNA扩增测序初步鉴定为Pseudomonas putida;在培养基pH值为8.0、培养温度为32 ℃、摇床转速为120 r/min的条件下,考察了该菌株降解邻氯硝基苯的能力,发现菌株42 h内将起始浓度为1.07 mmol/L的该化合物降解了约80%;经质粒检测,在OCNB-1菌株中发现一条质粒条带,选用7种内切酶对质粒pOCNB-1进行单酶切,得出质粒大小约为32 kbp;抗生素抗性实验表明菌株对红霉素、氨苄青霉素、青霉素钠的抗性与质粒无关,对利福平、氯霉素的抗性与质粒有关;通过细菌接合,质粒转移到无降解邻氯硝基苯能力的Pseudomonas.stutzeri受体菌中,接合子Pseudomonas.stutzeri能利用邻氯硝基苯为唯一碳源、氮源和能源,证明质粒为降解质粒.     

S-腺苷甲硫氨酸合成酶的可溶性表达

系统考察了pET可溶性表达系统对酵母来源的S-腺苷甲硫氨酸(SAM)合成酶基因的表达情况,结果显示:当采用含Nus.Tag融合标签的pET-44a为载体,trxB和gor双突变的Ori-gami为宿主时最适合目的蛋白的可溶性表达。进一步考察不同来源(大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌)SAM合成酶的可溶性时,也得到了相似的结论;比较发现酵母来源的SAM合成酶可溶性表达的比活力最高达60.9U/mg。     

致仔猪腹泻大肠杆菌的耐药性与质粒谱分析

对河北省不同地区发病猪场分离的已经过系统鉴定的12株猪源大肠杆菌,采用K-B纸片法进行了15种抗生素的耐药性检测,并提取质粒,对耐药谱和质粒谱型进行了比较分析。结果显示,分离菌株对氨苄西林的耐药率达到了100%,对阿莫西林的耐药率为91.7%,对四环素和复方新诺明的耐药率介于50%～70%。分离菌株存在多重耐药性,以耐4种、6种和7种药物为主,占总数的75%。对分离菌株耐药谱与质粒谱的分析表明,大肠杆菌的质粒携带与细菌的耐药性之间并没有明显的对应关系。     

表达大鼠FoxA1的慢病毒制备和鉴定

通过PCR扩增获得大鼠FoxA1的cDNA,构建慢病毒重组载体plv-rFoxA1-IRES-EGFP,并瞬时转染293T细胞观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及Western blot检测FoxA1的表达.通过钙转将该重组载体与辅助质粒△8.91,pVSV-G共转染293T细胞制备慢病毒.研究结果表明,大鼠FoxA1慢病毒质粒成功构建,并且证实所制备的慢病毒能感染细胞,使细胞有效表达FoxA1蛋白,为FoxA1的功能研究奠定了材料基础.     

c-Jun氨基末端激酶3结构域突变质粒的构建、鉴定与转染

为构建c-Jun氨基末端激酶3 (c-Jun N-terminal kinase3,JNK3)的p VP16-eGFP-Myc-JNK3活化环(activation-loop,A-loop)结构域突变型重组质粒,通过A-loop突变型JNK3的c DNA序列以及p VP16-eGFP-Myc的酶切位点设计引物,PCR扩增目的基因,使用限制性内切酶Mlu I与Xba I将基因克隆到p VP16-eGFP-Myc真核表达载体中,构建p VP16-eGFP-Myc-JNK3(A-loop)结构域突变型重组质粒。转化后,通过双酶切鉴定与DNA测序判断是否成功构建重组质粒,使用Trans IntroTMEL Transfection Reagent转染人胚肾(human emborynic kidney,HEK) 293T细胞,通过荧光显微镜下观察融合蛋白表达情况。结果表明:构建p VP16-eGFP-Myc-JNK3 (A-loop)结构域突变型重组质粒,双酶切鉴定和测序结果显示构建成功; p VP16-eGFP-MycJNK3 (A-loop)成功转染HEK293T细胞且表达。鼠源JNK3结构域突变型质粒构建成功,对进一步研究JNK3结构域在相关疾病的作用和机制提供实验工具。     

PCR快速检测常见具有毒性质粒的沙门氏菌

针对常见具毒性质粒的沙门氏菌的spvR基因，设计出PCR特异引物spvRP35-P36，以便快速检测出具有毒性质粒的沙门氏菌。验证采用13株沙门氏菌和4株非沙门氏菌，其中6株常见具有毒性质粒的沙门氏菌均获得特异性扩增，7株不舍毒性质粒的沙门氏菌均未获得特异性扩增，4株非沙门氏茵检测结果为阴性。结果表明，本文中设计的引物具有高度的特异性，适用于常见具有毒性质粒沙门氏菌的快速检测，此引物已获国家发明专利。     

固定剂和传代次数对线粒体荧光质粒pDsRed2-Mito荧光强度的影响

采用标记线粒体的荧光质粒pDsRed2-Mito转染PC12细胞,分别以95%乙醇、甲醇、丙酮和4%多聚甲醛作为固定剂对筛选后的细胞进行固定,最后在激光共聚焦显微镜下观察不同固定剂对荧光质粒荧光强度的影响.结果表明,95%乙醇或甲醇作为固定剂固定细胞后易导致荧光猝灭,而丙酮或4%多聚甲醛固定细胞后,对质粒荧光强度没有显著影响.不同传代次数对pDsRed2-Mito质粒的荧光强度也没有显著影响.因此,在选择pDsRed2-Mito质粒标记线粒体时,不用考虑传代次数的影响,宜选择丙酮或4%多聚甲醛作为固定剂才能最大化的保持质粒的荧光强度.     

云南热泉栖热菌属细菌(Thermussp)的质粒研究

从云南汤池、腾冲热泉（ｐＨ７．０～９．０，７０～９２℃）分离到８株专性嗜热非芽孢杆菌，最适生长温度６５～７５℃．鉴定为栖热菌属（Ｔｈｅｒｍｕｓ），根据生理生化特性测定，８株菌又分为两个群，分离自汤池样点的ＴＡ群５株菌氧化酶阳性，分离自腾冲样点的ＴＢ群３株菌，氧化酶阴性．通过质粒快速抽提，琼脂糖凝腋电脉发现，８株菌都含有一个质粒，大小略大于８．５ｋｂ．