生长条件对黄瓜线粒体类质粒稳定性的影响

“津新密刺”等一些黄瓜品种的线粒体中存在主基因组以外的3种环形DNA类质粒pC1、pC2和pC3。改变植株生长的温度、pH或以蔗糖溶液代替无菌水培养黄瓜植株，电泳均能检测到上述3种类质粒。应用ImageMaster VDS系统对各类质粒电泳带的密度进行扫描，通过计算3种类质粒的相对拷贝数及类质粒之间的拷贝数比值，分析不同生长条件对黄瓜类质粒稳定性的影响。结果表明，上述3种培养条件均对黄瓜线粒体类质粒的拷贝数有影响，其影响的程度因类质粒而异，pC3与pC1和pC2相比对环境改变更敏感，提示类质粒间的这种差异可能是类质粒复制方式不同引起的。     

黄瓜线粒体中DNA类质粒的分离与鉴定

应用琼酯糖凝胶电泳、S1酶处理及电镜技术，从黄瓜线粒体中分离并鉴定了三种环形DNA类质粒，依其分子由大到小，分别称之为pC1、pC2和pC3。以类质粒凝胶电泳带的荧光扫描值与DNA类质粒的分子长度之比作为类质粒拷贝数的参照值，对三种类质粒进行荧光扫描分析，结果表明pC3拷贝数明显高于pC1和pC2；pC2的拷贝数略高于pC1。     

外源基因在球形芽孢杆菌中的转化

为了扩大芽孢杆菌属的受体系统范围，对球形芽孢杆菌进行了质粒消除，并用含有溶葡球菌酶基因的质粒ｐＥ１９４ｃｏｐ６－１转化，结果表明，该酶基因在球形芽孢杆菌中获得了稳定，高效表达。     

阅读框架内乳腺癌cDNA文库的构建

目的:为构建高质量乳腺癌噬菌体展示文库,用pKE-2质粒载体经卡那抗性筛选富集开放阅读框架(open-reading frame ORF)内阳性克隆。方法:用Trizol试剂提取乳腺癌组织总RNA,分离纯化mRNA,经反转录合成双链cDNA。在双链cDNA末端加上定向EcoR/Hind接头,用EcoR和Hind消化接头,使形成两端分别带有EcoR和Hind粘性末端的双链cDNA,将其连接于带有EcoR和Hind末端的pKE-2质粒载体,转化大肠杆菌DH5α,经卡那抗性筛选,富集ORF克隆。结果:经过ORF筛选,文库中ORF克隆比例达到80%,较筛选前的5%提高75%。     

禽类多瘤病毒APV-1晚期基因多顺反子的EGFP标记载体构建和表达

为研究禽类多瘤病毒晚期基因多顺反子翻译起始调控的机制,设计和构建了以增强绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因替代病毒APV-1野生型的晚期结构蛋白VPs基因的真核双顺反子表达载体,并观察其在转染进入禽类原代成纤维细胞中的表达翻译状态.以APV-1的c DNA克隆(p HL1003)为模板,运用PCR技术扩增出与野生型病毒APV-1相同的Ori区、早期编码区和晚期Agno-1a区序列作为载体片段;从质粒p EGFP-N1中扩增出编码绿色荧光的EGFP DNA片段;经连接构成重组质粒p HL1003-GFP,通过脂质体细胞转染方法将质粒DNA转染到鸡胚胎和鹌鹑胚胎成纤维细胞中,通过细胞培养观察荧光表达状况.DNA序列分析证实了重组克隆中的EGFP序列与已知的质粒p EGFP-N1中EGFP序列一致.转染72 h后观察鸡和鹌鹑胚胎成纤维细胞,转染成功胚胎细胞明显表达较强的荧光,说明GFP可以在构建的双顺反子重组质粒的下游中正常表达并产生荧光.p HL1003-GFP重组质粒的构建及其在禽类原代成纤维细胞中的高效表达,为我们研究多顺反子翻译起始调控中Agno-1a基因的表达对下游病毒结构蛋白基因的翻译调控机制提供了简洁易用的系统和模型.     

水稻基因整合平台系统供体质粒pURKMT的构建

提高水稻产量,改良稻米品质是育种学家广泛研究的课题．随着现代生物技术的发展,水稻已成为植物基因工程的重要研究对象．许多实验室已成功地建立了一系列供外源基因转化水稻的系统．但是这些转化系统主要应用Ｔｉ质粒衍生的载体,通过Ｔ－ＤＮＡ左右两端的序列将目的基...     

A novel gene carrier based on amino-modified silica nanoparticles

Uniform-sized amino-modified silica nanoparticles have been prepared by the controlled synchronous hydrolysis of tetraethoxysilane and N-(β-amimoethyl)-γ-aminopropyltriethoxysilane in water nanodroplet of the water-in-oil microemulsion.These nanoparticles display positive charge potential at definited pH,This is due to the presence of amino groups on the surface of the nanoparticles,Nanoparticles-plasmid DNA complexes can easily form through electrostatical binding between the positive charges of the amino-modified silica nanoparticles and the negative charges of the plasmid DNA,The complexes can be also dissociated under alkaline pH or high ionic strength conditions.And enzymatic digestion of the plasmid DNA is almost inhibited by these nanoparticles complexes.A novel non-viral gene carrier based on the amino-modified silica nanoparticles is proposed under the combination of nanotechnology,biotechnology and gene engineering technology.The plasmid DNA can successfully cross various systemic barriers to COS-7 cells as well as mediate high expression of Green Fluorescence Protein(GFP)gene in cells by use of this novel gene carrier.     

一株来源于深海热液区嗜热细菌的分离及鉴定

从西南印度洋热液区沉积物样品中分离纯化获得一株中度嗜热产芽孢杆菌,命名为M6.菌株M6为革兰氏阳性菌,短杆状,可成对.菌株M6的生长温度为35～65 ℃(最适生长温度60 ℃),生长pH为6.5～8.5(最适生长pH为7.0～8.0),生长NaCl质量分数为0～4%(最适NaCl质量分数为2%),生长盐度为0～80人工海水(最适盐度为40).16S rRNA基因相似性分析表明,菌株M6属于不产氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus),与Anoxybacillus rupiensis菌株同源性最高,达99%;但16S～23S rDNA 间隔区PCR扩增分析表明,该菌与同属菌株有较大差异.通过以上形态学、生理特征以及分子生物学鉴定,认为菌株M6为不产氧芽孢杆菌属的菌株.另外,菌株M6可分泌胞外高温淀粉酶.菌株M6胞内含有内生质粒,其大小约为10 kb,命名为pAB01.     

制备12 kb重组质粒载体的方法

利用质粒载体pGEM-7Zf(+)克隆了一个长达9224bp的DNA片段,重组质粒大小达到12003bp.该重组质粒可以转化到JM109受体菌中,并且在随后的继代培养过程中具有较高的产量和相当高的稳定性.对于利用质粒载体来克隆DNA片段来说,设计的方法具有普遍的使用价值,对于较大的DNA片段克隆,该方法具有简便、可靠的特点,不仅能够保证克隆成功,而且极大的减少了筛选或鉴定重组菌的工作量.     

两种策略实现1,3-丙二醇关键酶基因的共表达

甘油脱水酶(GDHt)和1,3-丙二醇氧化还原酶(PDOR)是甘油歧化为1,3-丙二醇(1,3-PD)的两个关键酶。采用多顺反子重组和质粒共存两种策略,对来自克雷伯肺炎杆菌(Klebsiela pneumoniae)的两个关键酶进行共表达。构建表达载体pET-28a-dhaB1B2B3-dhaT将两酶基因dhaB1B2B3和dhaT用SD序列相隔,在E.coli BL21(DE3)高水平共表达了GDHt 3个亚基和PDOR,表达蛋白分别约占菌体总蛋白的18%、9%、7%和9%。质粒pET-28a-dhaB1B2B3和pET-22b-dhaT共转化E.coli BL21(DE3)得到稳定的双质粒系统,48h后84%的细胞能同时含有两种质粒,GDHt 3亚基和PDOR分别约占菌体总蛋白的16%、8%、6%和14%。两种酶在两种表达方法下均显示高于原始菌株的酶活力。