运动发酵单胞菌和大肠杆菌间穿梭质粒的构建

运动发酵单胞菌(Zymomonas．mobilis)是目前发现的乙醇发酵能力最强的微生物之一,被认为是进行大规模乙醇生产的潜在菌种;但由于其可利用的碳源范围窄,所以对其进行基因工程改造首先需要有较好的载体系统．以Z．mobilis内源质粒pZM2和大肠杆菌(E．coli)质粒pBR328、pACYC184为出发质粒,构建了三个Z．mobilis-E．coli之间的克隆型穿梭质粒,即pZB1、pZB21和pZB31．对它们在Z．mobilis CP4中的稳定性、拷贝数的初步比较分析表明：pZB21最稳定、拷贝数最高,pZB31次之,pZB1最差．进一步以pZB21为载体,在Z．mo- bilis CP4中表达E．coli的talB基因,酶活水平为0．087 U/mg蛋白．证明pZB21是能用于基因表达的、较为理想的Z．moblis-E．coli之间的穿梭载体．     

过表达B基因的转基因微型番茄的获得

以微型番茄M icro-T om核基因组DNA为模板,利用PCR方法扩增编码有色体特异性的番茄红素β-环化酶的B基因编码区,并将B基因与在高等植物中组成型表达的C aM V 35S启动子融合,构建成双元载体pL e-BZN,导入农杆菌,利用农杆菌介导的遗传转化方法转化到微型番茄M icro-T om中,通过抗性筛选和PCR鉴定,成功获得了多株转基因微型番茄,为获得富含β胡萝卜素的转基因微型番茄奠定了基础.     

电击法转移含人凝血因子Ⅸ基因重组质粒的影响因素

反转录病毒载体在基因治疗中可能会产生野生型病毒而引起安全性问题，本文研究含ＦＩＸｃＤＮＡ重组质粒基因治疗血友病Ｂ的可能，构建了不具反转录病毒载体结构的两重组质粒ｐＳＣＩＸＴＮ和ｐＣＩＸＴＮ，前者含ＳＶ４０早期启动子和ｈＣＭＶ启动子共同控制的ＦＩＸ ｃＤＮＡ，后者仅含ｈＣＭＶ启动子控制的ＦＩＸｃＤＮＡ，它们都含有ＴＫ启动子驱动的ｎｅｏ基因，通过电击法将基因转移到ＰＡ３１７和ＨＴ１０８０细胞，在ＨＴ１     

重组人角质细胞生长因子(KGF-2)在毕赤酵母中的克隆与表达

利用RT－PCR技术，从体外培养的人胚胎成纤维细胞中扩增出人角质细胞生长因子（KGF－2）的cDNA及基因序列，并将其基因序列克隆入质粒pGEM-T Easy中，经测序与文献报道序列一致，将KGF－2基因切出后定向插入酵母分泌性表达质粒pPICZαA中，转化毕赤酵母菌株GS115，获得的重组体经甲醇诱导可表达出人角质细胞生长因子KGF－2，表达的KGF－2经Ni^2 柱亲和层析纯化后，有很好的生物学活性。     

pEgr1-Trail重组质粒联合电离辐射对MCF-7细胞杀伤效应的实验研究

目的研究p Egr1-Trail重组质粒联合电离辐射对MCF-7细胞的杀伤效应,为增强肿瘤放疗效果提供实验证据.方法应用Annexin V-EGFP/PI双染法检测细胞凋亡;应用酶标仪检测细胞增殖;应用流式细胞仪检测细胞周期.结果不同处理组作用MCF-7细胞后24 h、不同剂量X射线照射后24 h后,各处理组MCF-7细胞的生长抑制率呈上升态势,生长抑制由弱到强的顺序为:2.0 Gy,p Egr1-Trail+0.5 Gy,5.0 Gy,p Egr1-Trail+1.0 Gy,p Egr1-Trail+2.0 Gy,Egr1-Trail+5.0 Gy.各处理组联合2.0 Gy X射线照射后6 h,细胞凋亡率开始上升,48 h达高峰,其中p Egr1-Trail+2.0 Gy组与其他各处理组比较差异具有统计学意义,且细胞凋亡最为显著(P0.05).在细胞周期方面,2.0 Gy X射线照后6 h各处理组S期细胞百分数呈现上升趋势,24 h达高峰;照后24 h,G_2+M期细胞百分数开始上升,且各处理组比较差异均具有统计学意义(P0.05);照后48 h,G_2+M期细胞百分数达到最高,依旧是p Egr1-Trail+2.0 Gy组上升最显著.结论 p Egr1-Trail重组质粒联合电离辐射作用于肿瘤细胞表现出协同杀伤效应,促凋亡作用强于单独X射照射组或p Egr1-Trail基因干预组.     

纳豆激酶基因在巴斯德毕赤酵母中的表达

构建pPICZαA-NK重组质粒，并转化入E.coli TOP-10中，得到转纳豆激酶基因工程菌，提取重组质粒经单酶切，双酶切，PCR分析及序列测定，证明克隆到载体pPICZαA上的外源基因即为纳豆激酶基因，将重组质粒pPICZαA-NK线性化后，分别转化毕赤酵母GS115与KM71，在含Zeocin^TM的选择性YEPD平板筛选到重组酵母，经检测重组酵母发酵上清液中具纳豆激酶溶纤活性，SDS-PAGE电泳结果表明外源蛋白的表达量占菌体蛋白的10%左右。     

用于骨移植的hCbfa1重组腺病毒载体的构建

克隆hCbfa1的cDNA基因,构建其重组腺病毒载体,以用于研究hCbfa1腺病毒载体在人造骨移植中的作用.将hCbfa1的cDNA目的片段插入腺病毒柯氏质粒PAxCAwt中,再将此质粒与腺病毒DNA末端蛋白复合物共转染293个细胞,通过同源重组构建hCbfa1重组腺病毒载体.重组得到的阳性克隆经酶切、测序鉴定正确,包装纯化后,检测得病毒滴度为2×109PFU/mL,从而成功地构建了hCbfa1重组腺病毒载体,为下一步应用到人造骨移植的转基因治疗打下了基础.     

重组人尿激酶原基因的克隆及工程菌的构建与鉴定

利用RT－PCR技术,从人脐带静脉上皮细胞中克隆重组人尿激酶原基因,用表达质粒pET29a构建了重组质粒pET29a/prouk,并转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,作为工程菌。经IPTG诱导表达,在46kDa处有一明显表达条带,表达量为约占菌体总蛋白的20％。该菌种在贮存与复苏及传代过程中具有良好的质粒稳定性和表达稳定性。     

我国鸡白痢沙门氏菌病诊断与防治研究概况

鸡白痢沙门氏菌可感染各日龄、不同品种的鸡、其临床症状表现不尽相同、均严重影响鸡的生产性能．细菌学方法仍是不可或缺的诊断手段．随着血清学技术、PCR技术、快速检测试剂盒逐步应用于鸡白痢的检疫之后，对鸡白痢的防制巳跃上了一个新台阶，鸡白痢沙门氏菌的毒力质粒和耐药性研究，为药物、疫苗防治打开了新思路．减毒菌苗、灭活菌苗、脂多糖(LPS)抗原、卵黄抗体、活菌生物制剂、抗生素、磺胺药、中草药、有机酸等措施在鸡白痢的防治中发挥着重要作用。     

基因工程菌的发酵条件研究

为了获得商品化基因工程产品，要求所选用的基因工程菌高效表达重组蛋白．然而，随着发酵规模的扩大，诸多因素影响基因工程菌蛋白的表达．成功的大规模发酵有两个问题是重要的．一是质粒的稳定性，二是高密度发酵．本文从理论上阐明了ｐＨ，温度、溶氧、比生长速率等条件对重组蛋白产生影响的研究进展．