植物细胞DNA提取与PCR实验的设计及其关键参数的优选

以草本类型的蓼科5种植物为实验材料,研究了DNA提取方法。探讨了nrDNA ITS片段的PCR扩增方法,通过正交试验法,对该实验的关键步骤中PCR体系主要成分的最适含量进行了优化。为植物细胞DNA提取和PCR扩增这一现代生物学必不可少的实验教学和相关科学研究提供方法借鉴。     

大豆花叶病毒Sc株系外壳蛋白基因的部分序列分析

采用多聚酶链式反应（ＰＣＲ）扩增技术,体外扩增ＳＭＶ－Ｓｃ株系的外壳蛋白基因并进行部分测序。结果表明：所测５＇端１５０个核苷酸序列同已发表的ＳＭＶ－ＢＪ（北京分离物）、Ｓａ株系同源率分别为９５％和９３％,３＇端非编码区同ＢＪ株系同源率为８４％。     

建立实时荧光PCR快速鉴定鸡制品中鸡伤寒沙门氏菌的方法

建立基于Taqman探针实时荧光PCR检测鸡伤寒沙门氏菌(Salmonella gallinarum)的方法.根据GenBank公布的鸡伤寒沙门氏菌基因序列,设计引物和Taqman探针,采用实时荧光PCR进行特异性、灵敏性及模拟样品的检测实验.结果表明:特异性引物和探针可从34株鸡伤寒沙门氏菌菌株、26株其他血清型沙门氏菌和7株非沙门氏菌菌株中检测出全部的34株鸡伤寒沙门氏菌.以鸡伤寒沙门氏菌梯度稀释菌液DNA为模板进行实时荧光PCR实验,菌株模板浓度与Ct值呈良好线性关系,线性系数(R2)为0.999,扩增效率为88.2%,最低检测浓度为5cfu/mL.对已接种鸡伤寒沙门氏菌的模拟样品同时进行实时荧光PCR检测和传统方法鉴定,两者结果一致.该方法特异性好、灵敏度高,是快速鉴定鸡伤寒沙门氏菌的有效方法.     

烟酰胺对紫色红曲菌生长和次级代谢产物合成的影响

以北京市食品添加剂工程技术研究中心实验室保藏的 Monacolin K产量稳定的紫色红曲菌M1为出发菌株,利用紫外-可见分光光度法、超高效液相色谱法以及实时荧光定量PCR法,通过测定红曲色素含量、Monacolin K含量等,探究烟酰胺添加对红曲菌合成次级代谢产物的影响。结果表明:实验组红、橙、黄3种色素产量与对照组菌株相比均有所降低；Monacolin K产量较对照组提高了31.34%,达到124.23mg/L。电镜观察发现,实验组菌株的孢子头和菌丝体褶皱程度明显多于对照组菌株。实时荧光定量PCR发现,实验组与Monacolin K产量相关的mokA、mokB、mokC、mokD、mokE、mokF、mokG和mokH基因的表达量均呈上调趋势,而mokI基因呈下调趋势。实验以烟酰胺为添加物进行探究,以期为红曲菌培养基优化,高产Monacolin K产品筛选提供参考。     

菌落PCR方法的建立及其与常规PCR方法的比较

为建立一种快速、经济、敏感的PCR检测方法,以直接检测出环境、海产品等中的靶基因,通过PCR扩增已知携带tlh和tdh基因的副溶血弧菌标准菌株,并和常规PCR方法比较,初步建立了菌落PCR技术;再以副溶血弧菌标准菌株为阳性对照,以本实验室自海洋环境中分离得到的数株野生菌株为检测对象,采用新建立的菌落PCR以及常规PCR方法对它们进行扩增比较,进一步证明了菌落PCR技术检测携带相关基因菌株的可靠性．通过比较,发现菌落PCR和常规PCR的结果相当一致,两种方法均能扩增出阳性对照标准菌株中tlh和tdh基因．     

水分胁迫下杂交稻幼苗体内脯氨酸积累对膜指过氧化的影响

水分胁迫下杂交稻幼苗体内游离脯氨酸明显积累,腊脂过氧化产物丙二醛（MDA）含量显增加,脯氨酸积累速度同MDA的增生速度相关联。以外源脯氨酸对杂交稻幼苗进行预处理后胁迫,结果表明,外源脯氨酸能提高脯氨酸在稻苗体内的积累速度,能明显降低水份胁迫下杂交稻幼苗体内MDA含量增生水平,对膜脂过氧化有抑制效应。     

真藓科(Bryaceae)植物RAPD反应体系的建立

真藓科植物的分子系统学研究是藓类植物研究中的新热点,RAPD是分子系统学研究中被广泛采用的一项重要技术.为了开展真藓科植物的分子系统学研究,通过单因素实验结合正交实验建立了适于该科植物的RAPD最佳反应体系:dNTP为0.2 mmol/L,随机引物0.4μmol/L,Taq DNA聚合酶1.25 U,Mg2 为2 mmol/L,模板DNA为50 ng,扩增体系为25μL.确定扩增程序:95℃预变性7min;94℃变性1min,36℃退火1min,72℃延伸2 min,40个循环;72℃终延伸7 min.并利用该体系从200条随机引物中筛选出了31条高度多态性的引物.     

实时荧光定量PCR检测多鳍鱼Shh基因表达标准品质粒和标准曲线的构建

为了快速、准确定量多鳍鱼Shh基因在机体组织中的表达水平,根据笔者克隆的Shh基因序列,选择其高度保守区域设计一对引物,对多鳍鱼各组织提取mRNA,经RT-PCR扩增,产物纯化后与pGEM-T-easy连接,转化大肠杆菌DH5α。筛选后得到重组标准品质粒,对重组标准品质粒进行酶切、PCR和测序鉴定,表明Shh基因保守区段已经成功克隆。将重组标准品质粒进行倍比稀释,然后以此为模板,进行荧光定量PCR,系统自动分析软件显示Ct值与标准品浓度的对数之间存在良好的线性关系。回归方程为y=-0.32x 10.47,回归系数为1.00。构建Shh基因表达检测标准品质粒和标准曲线,建立检测多鳍鱼Shh基因荧光定量PCR方法,为进一步研究Shh基因在组织中的动态分布和研究多鳍鱼系统发育奠定了基础。     

利用测交和PCR快速选择Xa21转基因杂交稻恢复系的纯合系

通过对测交群体的Ｘａ－２１基因特异ＰＣＲ分析,辅助选择明恢６３和盐恢５５９两个种型杂交稻恢复系的转基因后代,获得了含单个拷贝的Ｘａ－２１转基因纯合株系,这些Ｘａ－２１纯合的转基因恢复系可用于配制抗白叶枯病杂交稻．     

新型冠状病毒RNA标准物质

研制了一种新型冠状病毒(coronavirus, SARS-CoV-2)体外转录RNA标准物质,用于SARS-CoV-2病毒RNA检测的量值溯源.目标基因范围涵盖已公布的SARS-CoV-2病毒检测的3个主要靶标基因:核壳蛋白N基因全长(基因组坐标:28274-29533, GenBank:MT027064.1)、包膜蛋白E基因全长(基因组坐标:26245-26472, GenBank:MT027064.1)、开放阅读框1ab(ORF1ab)基因片段(基因组坐标:13321-15540, GenBank:MT027064.1).通过采用数字聚合酶链式反应(digital PCR, dPCR)方法进行多实验室联合定值,确定了该标准物质的量值为N、E和ORF1ab基因的拷贝数浓度.研究结果表明,该RNA标准物质量值可靠,均匀性良好,稳定性可满足运输要求.进一步地,通过在临床检验、多家不同原理的病毒检测试剂盒生产企业、方法开发实验室等试用,验证了RNA标准物质的普适性.这一RNA标准物质的研制为新型冠状病毒检测试剂盒的质量控制提供了计量学依据,为防控流行性疾病提供了便利.