PCR扩增黄鳝和刺鳅SRY盒基因

性别是从酵母到人类几乎所有真核生物所共有的性状,性别决定机制的探索一直是生物学研究的热点之一,其研究工作涉及遗传、发育和进化等领域,它不仅具有重要的理论意义,而且对实现动物性别的人为控制,对认识人类性分化异常等多种与性别有关的疾病,准确地进行产前性别诊断和预防性连锁疾病等都有重大的现实意义,同时,对性别这一在进化上保守性状进行深入研究,将会为生物的进化分析提供新的线索。近年来,在人和哺乳动物性别决定机制的研究方面,已取得突破性进展。位于Y染色体上的SRY基因被认为是性别决定的关键基因。在胚胎发育过程中,它决定着睾丸的形成,由此决定着个体向男(雄)性方向发育。最近的研究表明,在其他染色体上以及在进化程度明显不同的物种中,也广泛存在SRY的同源基因。这些拟SRY基因现已被命名为SRY盒(SRY-box)或者SOX基因。鱼类约占脊椎动物种数的一半,作为较低等的脊椎动物,是从水生到陆生进化上的一个重要环     

Pfu DNA聚合酶在大肠杆菌Rosetta(DE3)中的表达及快速纯化

来源于Pyrococcus furiosus COM1菌的Pfu DNA聚合酶具有保真性高、延伸速度快、热稳定性强等特点,能够提高PCR反应过程中的扩增效率,减少错误碱基掺入率.以大肠杆菌Rosetta(DE3)为重组细胞,利用一种快速表达纯化方法,让Pfu DNA聚合酶的表达纯化过程变得更加简便,并维持其高活性.结果表明,Pfu DNA聚合酶在大肠杆菌Rosetta(DE3)中能够进行大量表达,同时60℃高温水浴能有效去除杂蛋白,简化纯化步骤及提高Pfu DNA聚合酶纯度.经过一系列纯化步骤处理后,Pfu DNA聚合酶仍然能够保持较好的酶活,且在100μL PCR反应体系中,加入4μL的1 mg/mL Pfu DNA聚合酶液效果最佳.     

重庆荣昌犬钩虫ITS及5.8SrDNA的克隆及序列分析

利用聚合酶链式反应(PCR)扩增犬钩虫rDNA的ITS及5.8S序列,然后将PCR扩增产物回收纯化后连接 到pMDTM19-T载体上进行克隆.重组质粒通过菌落PCR鉴定,将阳性重组质粒进行序列测定并且进行序列分析. 结果显示,5株犬钩虫荣昌分离株ITS序列的总长为833bp~834bp.ITS-1序列总长无差异,但存在个别碱基的 差异;5.8S序列总长与序列均无差异;ITS-2序列总长存在差异(221bp~222bp).通过与GeneBank上报道的其 他钩虫的ITS序列进行相似性分析,发现犬钩虫荣昌分离株(RCF)与犬钩虫广州分离株相似性最高,为99.9%, 与美国北海狮弯口属钩口线虫ITS序列的相似性最低,为86.1%.表明ITS可作为分子标记用于犬钩虫种属以及 种间的鉴定.该研究结果旨在为今后犬钩虫的分类鉴定、种群遗传关系、分子流行病学调查以及对该病的防治等方 面的更深入研究奠定基础.     

微囊藻毒素和脂多糖对鲢鱼和草鱼肝脏去毒相关基因活体诱导表达的影响

采用50μg·(kg体质量)-1的微囊藻毒素·LR(MC-LR)、2 mg·(kg体质量)-1的脂多糖(LPS)和50μg·(kg体质量)-1 MC-LR+2 mg·(kg体质量)-1 LPS分别活体腹腔注射鲢鱼、草鱼,采用实时荧光定量PCR方法测定MC-LR和LPS对鲢鱼、草鱼肝脏alpha-谷胱甘肽S-转移酶(GSTA)、rho-谷胱甘肽S-转移酶(GSTR)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和解偶联蛋白2(UCP2)等去毒相关基因活体诱导表达的影响.结果表明,鲢鱼、草鱼GSTA和GSTR的不同诱导变化除与两种淡水鱼类对毒素的耐受性相关外,还与毒索剂量、诱导时间等因素相关.LPS对GSTA和GSTR基因组成型、诱导型的不同作用,可能与调制因子LPS对不同生态习性淡水鱼类肝脏GST基因表达水平的调制作用不同有关.UCP2与GPX也分别在抑制过量ROS发生方面与肝脏抗氧化胁迫等方面起重要作用.     

热诱导表达的水稻OsBBX30基因克隆和表达分析

生物信息学分析表明:OsBBX30基因启动子含有与逆境相关的作用元件HSE.为进一步了解OsBBX30基因在生物体内受热诱导,通过OsBBX30基因克隆构建原核表达和实时定量PCR分析,证实OsBBX30基因表达受热胁迫诱导,能增强大肠杆菌的耐热能力,为深入了解该家族基因和挖掘水稻耐热基因奠定基础.     

t-PA cDNA基因的克隆及测序

从基因工程菌株里氏木霉中提取基因组DNA,根据t-PAcDNA序列设计一对引物,利用PCR法扩增目的基因,将其与pMD18-T-Vector连接后转入大肠杆菌,通过Amp抗性和蓝白斑筛选出重组菌株,PCR法和双酶切法鉴定后再进行测序鉴定,测序结果表明:克隆的t-PAcDNA的第34位、450位和521位基因发生了突变。     

meq与lorf9双基因缺失显著降低超强马立克氏病病毒的复制能力

马立克氏病病毒(Marek’s disease virus, MDV)感染引起以鸡体严重免疫抑制和内脏肿瘤为主要特征的马立克氏病(Marek’s disease, MD). MDV的感染过程分为早期溶细胞感染、潜伏感染、肿瘤转化和再次激活感染4个阶段.为了研究构建的meq与lorf9双基因缺失重组毒株在宿主体内的复制特性,应用实时荧光定量PCR技术(Realtime PCR)对MDV感染后第6, 14日龄鸡脾脏中的病毒拷贝数进行检测,结果表明,双基因缺失病毒在早期溶细胞感染和潜伏感染期中的复制显著降低;对MDV感染后第63日龄鸡的脾脏和羽毛囊中的病毒拷贝数进行定量分析,结果表明meq与lorf9双基因缺失也显著降低了病毒在肿瘤转化期和再次激活阶段的感染拷贝数.本研究为进一步探讨meq与lorf9双基因缺失在MDV致病和免疫机制中的作用提供了理论基础.     

SEA对PML-RARα多肽体外诱导外周血单个核细胞TCRζ链表达的作用

目的:了解金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)联合PML-RARα融合多肽体外诱导正常人外周血T细胞活化TCRζ链基因表达情况.方法:利用T细胞液体培养法分别与正常人外周血淋巴细胞加入PML-RARα融合多肽、SEA和SEA联合PML-RARα多肽诱导培养T细胞,其中SEA刺激包括培养初始或培养第5天加入SEA两组(PS、PSI),并设空白对照组(不加多肽及SEA).分别收集各组培养20 d后细胞提取mRNA并合成cDNA,采用SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR和相对定量检测TCRζ链在不同组别T淋巴细胞中的表达情况,以β2微球蛋白基因(β2M)作为内参,根据相对定量公式:2<'-△△Ct>分析TCRζ链表达差异.结果:与空白组相比,联合诱导组在培养初始加入SEA及第5天加入SEA的培养T细胞中TCRζ链表达上升,而单独SEA诱导组的TCRζ链表达下降.结论:超抗原SEA联合PML-RAR α多肽体外诱导T细胞可使TCRζ链基因表达水平升高,有望为研制急性早幼粒细胞白血病疫苗提供新的切入点.     

武汉东湖PP类噬藻体的遗传多样性研究

设计出一对特异性扩增噬藻体PP序列的引物159B,利用该引物对若干季节的武汉东湖不同湖区的PP类噬藻体进行PCR扩增和PCR产物直接测序.结果表明:PP类噬藻体PcR扩增序列的差异不大(最大不超过12%),推测环境中PP类噬藻体的遗传多样性较为稳定.     

利用原位RT-PCR技术检测库尔勒香梨中苹果茎沟病毒

以已知带有苹果茎沟病毒的香梨的叶片为材料,研究了香梨病毒叶片石蜡切片IS-RT-PCR检测技术.应用了直接原位RT-PCR反应,简化了试验步骤,缩短了试验周期,确定了苹果茎沟病毒在叶片中的分布位置.试验中设置了多种阴性对照,结果表现为:阴性对照组织中均未显现蓝紫色,而阳性材料组织的一些细胞表现出明显的蓝紫色,说明苹果茎沟病毒在叶片中主要分布于细胞中的栅栏组织.