过量表达苏氨酸脱水酶对谷氨酸棒杆菌合成L–异亮氨酸的影响

考察过量表达解除反馈抑制的苏氨酸脱水酶对谷氨酸棒杆菌发酵生产L–异亮氨酸的影响.将解除反馈抑制的苏氨酸脱水酶基因ilvA(F383V)连接大肠杆菌/谷氨酸棒杆菌穿梭质粒pXMJ19,过量表达于L–异亮氨酸生产菌株Corynebacterium glutamicum YILW.经5 L发酵罐分批补料发酵产酸实验,与出发菌株C.glutamicum YILW相比,耗糖高峰期滞后,L–异亮氨酸产量增加了10.3%,副产物L–蛋氨酸、L–赖氨酸含量分别降低了33.3%2、6.5%,发酵液中没有L–苏氨酸的累积,乳酸的累积量增加了41.7%.对发酵稳定期的代谢流分布研究表明,过量表达解除反馈抑制的苏氨酸脱水酶使HMP途径流量增加了31.7%,L–异亮氨酸生物合成途径的代谢流提高了8.5%.     

罗伊乳杆菌转化甘油能力的原位再激活

考察罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)静息细胞转化甘油的重复利用,甘油脱水酶的原位再激活,以及补加培养基对再激活甘油脱水酶的变化.结果表明:菌体经二次转化后基本丧失转化能力,甘油对胞内甘油脱水酶具有强烈的抑制灭活作用;确证胞内存在甘油脱水酶再激活体系;不具转化甘油能力的L.reuteri可被补加的培养基在一定程度上再激...     

回用酵母发酵生产甘油

回用酵母发酵生产甘油的发酵周期比一次性菌种发酵短４０～６０ｈ,平均产甘油率（８４６％）、转化率（４１６％）与一次性菌种发酵相当．采用回用酵母、高营养、低初始糖浓度、分批补料的工艺,不仅发酵周期短,而且平均产甘油率达１００２％,转化率达４６％,残糖较低,因此,此工艺对目前许多甘油发酵厂家具有一定应用价值．     

重组甘油脱水酶的活性鉴定

通过MBTH方法对重组甘油脱水酶活性进行检测。确定稳定的酶活检测系统．结果显示重组甘油脱水酶的活性明显高于野生菌．此外，甘油脱水酶单个亚基及亚基两两组合未检测到酶活性．这一结果将对酶活性研究具有重要的意义．     

耐高渗压酵母的甘油发酵研究:ⅡGW-11菌株的发酵条件试验

甘油是国防和民用工业的一种重要原料,日前市场供需矛盾突出。耐高渗酵母发酵法制取甘油是解决这一供求矛盾的有希望的途径,而高产菌株选育是该途径的基础。我组1987年从广西自然环境中筛选获得一株产甘油的菌种GW-11。本文是通过对该菌株的培养基组成及培养条件的试验。以获得最佳发酵条件,并对其甘油生产性状进行考察。结果表明:优化发酵条件与原试验条件相比,该菌发酵甘油产率由原8％提高到14.0％,对糖转化率由原来的40％,提高到46.7％,GW—11是一株具有潜在工业生产价值的耐高渗的甘油发酵生产菌。     

对生玉米5-氨基酮戊酸脱水酶的简单快速纯化

以聚乙二醇６０００分级沉淀、ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－６Ｂ,ＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ层析和制备电泳初步纯化了对生玉米的５－氨基酮戊酸脱水酶,它在ｐＨ８．５时比活为３１Ｕ／ｍｇ蛋白,酶纯化了１１２倍,得率为１２％,其亚基分子量为４１ＫＤ,它可以用于酶促合成胆色素原,也可用于联合法测定胆色素原脱氨酶的酶活     

两种策略实现1,3-丙二醇关键酶基因的共表达

甘油脱水酶(GDHt)和1,3-丙二醇氧化还原酶(PDOR)是甘油歧化为1,3-丙二醇(1,3-PD)的两个关键酶。采用多顺反子重组和质粒共存两种策略,对来自克雷伯肺炎杆菌(Klebsiela pneumoniae)的两个关键酶进行共表达。构建表达载体pET-28a-dhaB1B2B3-dhaT将两酶基因dhaB1B2B3和dhaT用SD序列相隔,在E.coli BL21(DE3)高水平共表达了GDHt 3个亚基和PDOR,表达蛋白分别约占菌体总蛋白的18%、9%、7%和9%。质粒pET-28a-dhaB1B2B3和pET-22b-dhaT共转化E.coli BL21(DE3)得到稳定的双质粒系统,48h后84%的细胞能同时含有两种质粒,GDHt 3亚基和PDOR分别约占菌体总蛋白的16%、8%、6%和14%。两种酶在两种表达方法下均显示高于原始菌株的酶活力。     

同源重组敲除三角褐指藻基因的研究

为探索应用基因敲除技术研究三角褐指藻基因功能的研究体系,本文以三角褐指藻甘油激酶基因作为靶基因,构建了同源重组基因敲除载体,利用微弹轰击法将该载体成功转化至三角褐指藻中,经100μg/mL Zeocin筛选和PCR验证获得了34个阳性转基因藻株;并进一步对三角褐指藻甘油激酶基因敲除转基因藻株的甘油激酶表达量和生长两方面进行分析,结果显示胞外甘油兼养不影响转基因藻细胞生长,甘油激酶不表达或表达量降低.本文通过构建敲除载体,完成了遗传转化,筛选获得阳性转基因藻,并进一步研究了转基因藻的性状,最终建立了应用同源重组基因敲除技术靶向研究三角褐指藻基因功能的研究体系.     

克雷伯氏肺炎杆菌生产1,3-丙二醇代谢途径中的酶活变化

考察了不同条件下克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella.pneumoniae)合成1,3-丙二醇(1,3-PD)的3种关键酶(甘油脱氢酶(GDH)、1,3-PD氧化还原酶(PDOR)及甘油脱水酶(GDHz))的表观酶活变化。结果显示:这3种酶的酶活变化与Klebsiella.pneumoniae的1,3-PD代谢不完全相关。用SDS-PAGE电泳分析上述不同发酵条件下酶活变化,结果显示不同于3种酶的蛋白条带,Mr约为4.0×104位置的蛋白条带有明显的变化,这可能与菌体代谢过程相关,结论有待进一步深入研究。     

大肠杆菌酒石酸脱氢酶β亚基的克隆、表达、纯化及包涵体的复性

利用PCR技术从大肠杆菌BL21中获取酒石酸脱氢酶β亚基基因(TtdB),并将之克隆到质粒pUC18上,转化大肠杆菌DH5α细胞.经测序证明序列无误后,将之与表达载体pTrcHisC连接,在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE和双波长扫描分析,确定酒石酸脱氢酶β亚基在大肠杆菌中表达时以包涵体形式存在.目的蛋白用TALON金属亲和树脂纯化,通过分步透析逐步去除变性剂的方法复性.复性产率可达90%.