苏云金芽孢杆菌猝倒亚种Cry1Aa13基因的克隆及序列分析

根据Gen Bank中Cry1A类基因序列设计一对特异性引物，以苏云金芽孢杆茵猝倒亚种质粒DNA为模板，应用PCR扩增技术得到一大小约为3．6kb的DNA片段(Cry1Aa13)．通过引物步行法测定该片段长3598bp，其中开放阅读框(ORF)长3540bp，编码1180个氨基酸，分子量为133．49kD，等电点pI=5．0．序列比较表明该基因与Cry1Aa类基因高度同源(达95％以上)，该基因已在GenBank中登录，登录号为AF510713，并被Btδ-内毒素基因国际命名委员会正式命名为Cry1Aa13。     

常规PCR与RACE结合法快速从cDNA文库中克隆基因

首先根据Fe(Ⅱ)-转运蛋白基因家族的保守区设计同源的常规PCR引物(F1，R1)，扩增出490bp的特异片段。然后根据RACE法原理，巧妙地设计3′RACE(F2)和5′RACE(R3)特异性引物，使两者既能分别与文库载体上的筛选扩增引物配对扩增cDNA 3′和5′末端序列，又能使扩增出的3′RACE和5′RACE产物序列有重叠部分；另外设计引物时还兼顾到使F2和R3也能配对，从而能对3′RACE和5′RACE扩增产物进行双特异性引物常规PCR鉴定。该方案不但能够直接根据序列鉴定3′RACE和5′RACE产物是否为同一基因序列，还能快捷地用常规PCR鉴定3′RACE和5′RACE扩增产物是否为特异性扩增，避免了对非特异性扩增产物的克隆测序等繁琐的鉴定过程，优化了基因克隆策略。最后根据拼读出的全长序列设计引物(F4，R4)扩增出完整编码区。应用该方法成功地从小金海棠缺铁处理的根系cDNA文库中克隆了Fe(Ⅱ)-转运蛋白基因的cDNA。说明该方案是一种从cDNA文库中克隆目的基因的快捷优化方法。     

一个特殊的顺式发夹核酶对感染烟草原生质体的影响

研究一个烟草花叶病毒(TMV)cDNA3′末端被特异切割的发夹核酶对感染原生质体的作用。选用一个外源基因绿色水母荧光蛋白(GFPuv)作为报道基因，取代了大部分的CP编码区域，以研究在烟草原生质体中发夹核酶对TMV载体的复制，通过GFP的表达来确定表达量。顺式发夹核酶对TMV载体感染效率的影响通过体外转录来观察。TMV GFPRIB体外转录感染原生质体的效率比与其不含该核酶的对应物的感染效率高3～5倍。Northern杂交结果表明，包括核酶在内的3’末端非病毒序列在体外转录反应开始后就被顺式发夹核酶切除了。当直接用载体DNA pSTMVGFPRIB感染原生质体时，感染原生质体的数量比与之相对应的pSTMVGFP NOS感染原生质体数多50％～80％。     

苹果褪绿叶斑病毒库尔勒香梨分离物外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达

将ACLSV CP基因克隆到表达载体ρET-28a( )中，转化大肠杆菌BL21，筛选得到阳性克隆pET-ACP，用IPTG诱导使其表达，SDS-PAGE电泳分析表明，预期的22kD外壳蛋白在大肠杆菌中得到大量表达，并加以纯化，用于制备抗血清。     

特种玉米栽培技术要点

特种玉米可分为两类：专用玉米和优质玉米。像甜玉米、糯玉米、爆裂玉米、青饲青贮玉米属于专用玉米，其用途单一，不能作它用；高油玉米、优质蛋白玉米属于优质玉米。特种玉米在栽培技术上要求比较严格，需要层层把关，否则当代所结的籽粒可能会失去特种玉米的性质，影响经济效益和社会效益。现将特种玉米栽培技术要点总结如下。     

O型口蹄疫病毒VP4蛋白一个保守性表位的精细鉴定

口蹄疫病毒(FMDV)的结构蛋白VP4在7个血清型之间是非常保守的,对其抗原表位最小基序的测定有助于开发广谱性多肽疫苗.本研究采用生物合成肽法,利用豚鼠抗FMDV O型标准血清,对最新流行的FMDV O型毒株O/BY/CHA/2010的VP4蛋白进行了线性表位扫描作图研究.结果表明:在覆盖VP4蛋白全长序列的10个18聚肽中,发现1个能与豚鼠抗FMDV O型标准血清发生免疫印迹反应的抗原性肽VP4-3;B细胞表位鉴定确定了抗体识别VP4-3的最小基序是INNYYM;该表位位于VP4蛋白的三维结构表面;对7个FMDV血清型的122个毒株同源蛋白质进行序列比对,发现这一表位在7个FMDV血清型的120个毒株中是100%保守.     

鳗鲡病原菌二联外膜蛋白基因工程表达载体的构建

根据鳗鲡病原性嗜水气单胞菌Ⅱ型孔蛋白(porinⅡ)和迟钝爱德华氏菌外膜蛋白S(ompS2)的基因全长序列,分别选取这两个全长序列中表达其蛋白质膜外部分且理论免疫原性较好的两个基因片段,通过融合PCR技术连接这两个外膜蛋白基因片段.根据表达载体(pGEX-2T-His)的限制性酶切位点在连接序列片段的两端引入限制性酶切位点BamHⅠ和EcoRⅠ,成功构建了双外膜蛋白基因片段重组表达载体(pGEX-2T-His-porinⅡ-ompS2).表达载体理论表达产物的蛋白质结构预测表明表达产物无信号肽和跨膜区,不存在三级结构;亲水性和免疫原性预测分析表明该表达蛋白理论上为可溶性蛋白并具有丰富的抗原决定簇,本研究为该表达载体的蛋白表达、纯化以及表达产物的免疫原性研究奠定了基础.     

一种蛋白-药物结合常数的测定方法

目的建立一种蛋白-药物结合常数的测定新方法。方法以固定化牛血清白蛋白为固定相,磷酸盐缓冲溶液为流动相,获得不同进样量下药物的液相色谱保留参数,以溶质进样量与保留值的关系方程进行拟合,计算蛋白-药物结合常数(直接进样法)。结果测定了咖啡酸(CA),汉黄芩素(WO)和木犀草素(LU)3种药物与固定化牛血清白蛋白(BSA)在人体生理条件(37℃,pH7.40)下的结合常数,其数值高于竞争置换法,但与相关文献数据接近。结论直接进样法可作为一种新方法用于研究蛋白-药物的相互作用。     

pH和盐浓度对火龙果种子分离蛋白功能特性的影响

以火龙果(Hylocereus polyrhizus)种子为材料,脱脂后分析其成分。采用Osborne分级分离法得到三种火龙果种子分离蛋白,检测其表面疏水性、巯基含量、热变性温度、氨基酸成分等理化性质,分析pH和NaCl浓度对火龙果种子分离蛋白的溶解性、持水性、发泡性、泡沫稳定性、乳化性、乳液稳定性等功能特性的影响。结果表明,火龙果种子脱脂粉中含量最高的三种成分为粗蛋白(51.04%)、粗纤维(23.60%)和总多酚(15.26%);火龙果种子中分离得到白蛋白、球蛋白和谷蛋白,提取率分别为19.51%、14.07%和32.29%;白蛋白由2个亚基组成(分子量23.4kD和14.2kD),球蛋白由3个亚基组成(分子量分别为21.7kD、18.7kD和15.2kD),谷蛋白由3个亚基组成(分子量分别为49.5kD、34.2kD和18.6kD);白蛋白、球蛋白、谷蛋白热变性温度分别为59℃、58℃和91℃;谷蛋白的表面疏水性(2730)最高;白蛋白的总巯基(5.38 mmol/L)和游巯基(2.35 mmol/L)含量最高;3种分离蛋白中谷氨酸和精氨酸含量较高。4≦pH≦6范围内3种蛋白的溶...